糖尿病心肌病是糖尿病患者最为严重的并发症之一，同时也是糖尿病患者主要死亡原因。高血糖致心肌病变的主要特点是以心肌结构改变为主^[1-2]，从而导致心力衰竭，并有证据表明糖尿病是致射血分数保留性心衰的主要原因之一^[3]。因此对高糖环境对心肌细胞损伤的机制研究具有重要意义。游离钙离子作为第二信号广泛参与细胞生理活动的调节，其参与的心脏信号传导是十分复杂的，影响着心脏内多种信号通路的传导^[4]。高糖可以通过钙库操纵的的钙离子内流（SOCE）使细胞内钙离子浓度升高^[5]，当心肌细胞长期受高糖环境刺激时，高糖可通过G蛋白偶联受体途径和受体酪氨酸激酶途径使细胞内三磷酸肌醇（IP3）浓度增加^[6]，IP3首先作用于位于细胞内钙库（内质网）上基质相互作用分子（STIM）使钙库内钙离子释放进入胞浆，当钙库内钙离子清空后，STIM寡聚体化后转移到位于细胞膜ORAI和TRPC蛋白附近，激活ORAI和TRPC通道介导的钙离子内流^[7]。胞浆内浓度升高的钙离子可过度活化钙调神经磷酸酶（CaN）。CaN是迄今发现唯一一种受Ca²⁺调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶, 在心脏表达的CaN的活性只与CaNAβ相关^[8]，CaN使活化的T细胞核因子（NFAT）去磷酸化激活，活化的NFAT蛋白能在核内保持长时间的活化状态^[9]。NFAT3作为CaN/NFAT3信号通路的下游分子最终决定了相关目的基因的表达^[10-11]，使用钙调神经磷酸酶抑制剂证明NFAT3的入核能被显著抑制，这一发现证实CaN调控着NFAT3的激活入核^[12]。研究表明，Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路在心血管疾病发病过程中有着重要的作用，其在心肌肥大和心肌纤维化等过程都有参与^[13-15]，在高糖刺激下Ca²⁺- CaN-NFAT3作为心肌肥大信号被激活并参与相关炎症因子的调控^[16]。

线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）是乙醛脱氢酶家族成员之一，是一种位于线粒体内重要的醛类氧化酶，不仅是体内重要的氧化应激分子，对细胞凋亡也具有抑制作用。研究证实，ALDH2对心血管系统的保护作用不仅在单纯心血管疾病方面^[17-21]。在糖尿病大鼠模型中，通过低浓度酒精激活ALDH2，后者可以在大鼠心肌损伤中起保护作用^[22]。但是，激活ALDH2对抗高糖引起的心肌细胞损伤，是否通过下调Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路活性实现的目前尚未见报道，本研究探讨了高糖处理的乳鼠心肌细胞中ALDH2对Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路影响及其可能机制。

SD大鼠由蚌埠医学院实验动物中心提供且符合动物伦理；胰酶消化液(碧云天)；胶原酶2（索莱宝）；Hanks液（碧云天）；胎牛血清（四季青）；DMEM低糖、高糖培养基（HyClone）；Alda-1（SML0462, Sigma-Aldrich）；11R-VIVIT（TOCRIS）；钙调神经磷酸酶酶联免疫吸附试剂盒（上海酶联）；钙离子荧光探针Fluo-3 AM（碧云天）；乙醛脱氢酶2抗体、钙调神经磷酸抗体购自abcam；活化T细胞核因子-3抗体（CST）；β-actin购自Biosharp；DNA酶Ⅰ、5-Brdu（索莱宝）；BCA试剂盒（碧云天）。

出生3 d内乳鼠取心脏心尖部剪碎后经混合酶消化成单个细胞，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基接种于培养皿中，在5% CO₂，饱和湿度，37 ℃培养箱培养，在培养1.5 h后取出培养皿中培养液离心重悬后接种于新培养皿中并且再加入5-Brdu继续培养，此时培养的细胞则为较高纯度心肌细胞可进行实验。

用免疫荧光对培养心肌细胞进行鉴定。将培养皿中心肌细胞用胰酶消化后取少量细胞接种于6孔板中，剩余细胞重新接种于培养皿中，待6孔板中细胞完全贴壁后进行实验。先用PBS清洗1 min/3次，4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，PBS清洗5 min/3次；然后用0.1% TritonX-100对细胞进行打孔并放置培养箱中30 min，PBS清洗5 min/3次；用5% BSA封闭30 min并且PBS清洗5 min/3次后用1% BSA稀释的抗α-横纹肌肌动蛋白一抗（α-Sarcomeric Actin, α-SA, 1: 200，武汉博士德）孵育心肌细胞4 ℃过夜；次日PBS清洗5 min/3次后用含羊抗小鼠荧光标记二抗（1: 200，武汉博士德）孵育细胞1 h；PBS清洗后用DAPI（ZSGB，北京）进行核染；避光条件下用荧光显微镜观察。

实验共有以下分组：5.5 mmol/L糖对照组（M）、30 mmol/L高糖组（MH）、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）组（MHA）、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2抑制剂（Daidzin）组（MHD）、30 mmol/L高糖加乙醛脱氢酶2激动剂（Alda-1）和NFAT3抑制剂（11R-VIVIT）组（MHAV）。

Fluo-3 AM用无血清培养基配成2 μmol/L；弃去原细胞培养基，用PBS清洗细胞后给予2 μmol/L的Fluo-3于37 ℃，5% CO₂孵育30 min；弃去Fluo-3，PBS洗涤细胞2次后加培养基适量后荧光显微镜检测。

处理后细胞PBS洗涤1 min/3次后加适量胰酶消化细胞1 min，用含10%血清培养基终止消化，将混合液离心后PBS清洗再次离心，加入适量全细胞裂解液及PMSF裂解1 h后12 000 r/min 15 min离心，取上清。按照BCA试剂盒说明测蛋白浓度，制备10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，每孔上样60 μg。用60 V恒压浓缩胶电泳30 min，恒压90 V分离胶电泳90 min。将凝胶中已分离的蛋白质恒流200 mA 150 min电转到PVDF膜上；5%脱脂奶粉室温封闭条带2 h；用TBST稀释的一抗孵育条带4 ℃过夜，TBST洗涤条带4次，5 min/次；将洗涤后条带放入TBST稀释的二抗中37 ℃水浴1 h，TBST清洗条带4次，10 min/次。ECL发光法显影。

从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出板条，分别设置空白、标准、样品孔，除空白孔外各孔分别加入50 μL不同浓度标准品和样品。标准孔和样品孔每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱60 min。弃去液体，吸水纸吸干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸吸干，重复5次。每孔加入底物A、B个50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，测定各孔A_{450 nm}波长。

数据采用均数±标准差表示，采用GraphPad，prism 6进行统计学分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，各组均数比较采用HolmSidak（recommended）校正的t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

通过差速贴壁结合5-Brdu得到纯度较高的心肌细胞，并且通过对特异性表达于心肌细胞和骨骼肌细胞中α-横纹肌肌动蛋白进行免疫荧光染色后，心肌α-SA抗原免疫荧光呈阳性反应，为绿色，位于细胞浆内，DAPI细胞核染色为蓝色，Merged为α-SA和DAPI合成结果（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 心肌细胞免疫荧光鉴定 Figure 1 Immunefluorescence identification of cardiomyocytes (Original magnification: ×100).

使用Image-J软件进行图像分析，结果显示：各组细胞不同条件分别培养48 h后，与正常组相比，高糖组平均Ca²⁺荧光密度值明显增高（P < 0.01），与MH相比，MHA组荧光密度值显著降低（P < 0.01），MHD组荧光值进一步升高（P < 0.01，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 荧光探针检测各组[Ca2+]活性测定结果和各组[Ca2+]荧光染色观察 Figure 2 Determination of [Ca2+] level and fluorescence staining for detecting [Ca2+] in each group. A: Quantitative analysis of the mean fluorescence density of [Ca2+] in each group (Mean ± SD, n=5). *P < 0.01 vs MH, ***P < 0.01 vs MH; **P < 0.05 vs MH; B: Fluorescence density of [Ca2+] in primary cardiomyocytes with different treatments (×100).

通过Image-J分析曝光后条带灰度值显示：使用Image-J软件进行图像分析，各组细胞不同条件分别培养48 h后，与MH组相比，MHA组ALDH2表达升高（P < 0.05），而CaN、NFAT3表达相应减弱（P < 0.05）；与MHA相比，MHAV组ALDH2蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），NFAT3蛋白表达明显降低（P < 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blotting检测各组ALDH2、CaNAβ、NFAT3蛋白表达 Figure 3 Western blotting for detecting ALDH2, CaNAβ, and NFAT3 protein levels in primary cultures of cardiomyocytes in each group (Mean±SD, n=3). A: Western blotting of ALDH2 and β-actin; B: ALDH2 protein levels normalized by β-actin (*P < 0.05 vs group MH; **P>0.05 vs MHA); C: Western blotting of CaNAβ and β-actin; D: CaNAβ protein levels normalized by β-actin (*P < 0.05 vs group MH); E: Western blotting of NFAT3 and β-actin; F: NFAT3 protein levels normalized by β-actin levels (*P < 0.01 vs MH; **P < 0.05 vs MH; ***P < 0.05 vs MHA).

各组细胞分组如前，在不同条件下处理48 h结果显示：M组CaN浓度最低，在高糖诱导下细胞内CaN浓度显著升高（P < 0.01），给予Alda-1处理的MHA组细胞内CaN浓度有所降低（P < 0.01），而当单独给予Daidzin后CaN浓度较MH组升高显著（P < 0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 ELISA检测不同处理组细胞内CaN浓度 Figure 4 Concentration of CaN in primary cardiomyocytes with different treatments detected by ELISA (Mean±SD, n=3). *P < 0.01 vs MH, **P < 0.01 vs MH; ***P < 0.05 vs MH.

机体内长期高糖环境是导致心肌损伤重要因素，但具体机制尚不明确，因此本研究通过高糖诱导原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞来探索高糖致心肌损伤可能机制。本实验发现高糖环境下心肌细胞内钙离子浓度、细胞内CaN浓度、CaNAβ和NFAT3蛋白水平都显著增加，这些结果进一步验证高糖可激活Ca²⁺-CaNAβ-NFAT3信号通路。

研究发现^[5]原代培养的人脐静脉内皮细胞经高糖处理后，钙库操纵的钙离子内流（SOCE）相关蛋白活性升高，进而导致细胞内游离钙离子浓度升高，也有研究发现了类似的结果^[23-24]。细胞内升高的钙离子浓度可使细胞内CaN浓度、CaN和NFAT3蛋白表达量均明显升高^[22]。这些结果与我们的研究结果相符。以上说明CaN/NFAT3信号通路在介导高糖诱导的心肌损伤过程中发挥着重要作用，其机制可能是高糖环境引起心肌细胞内SOCE活性升高，引起细胞内游离钙离子浓度升高，导致依赖于细胞内Ca²⁺的CaN活化。使用钙调神经磷酸酶抑制剂证明NFAT3的入核能被显著抑制，这一发现证实CaN调控着NFAT3的激活入核^[12]。活化的NFAT3去磷酸化入核调控多种参与心肌肥大和纤维化基因的表达^{[8, 23]}，以上研究提示了Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路介导了高糖诱导的心肌肥大及纤维化等病理过程。

既往研究发现ALDH2可对抗糖尿病诱导的心肌细胞损伤^{[19, 22, 26]}，ALDH2抗细胞损伤可能与其可清除细胞内产生的乙醛和氧自由基密切相关^[27-28]，Pan等^[29]在培养的心肌细胞中发现了ALDH2的这种保护作用，我们研究发现ALDH2对于高糖诱导的心肌纤维化也具有一定的逆转作用^[30]，但ALDH2能否调控Ca²⁺-CaNNFAT3活性从而拮抗高糖引起的心肌细胞损伤目前未见报道。我们探讨了ALDH2与Ca²⁺-CaN-NFAT3通路的关系。首先我们使用高糖和乙醛脱氢酶2激动剂Alda-1共处理原代心肌细胞。结果显示ALDH2能够显著抑制高糖对钙离子浓度、CaNAβ浓度的上调作用。当进一步用高糖和ALDH2抑制剂Daidzin共处理原代心肌细胞，结果发现钙离子浓度、CaNAβ浓度较仅用高糖处理显著增高。此外，我们还应用了高糖、Alda-1和NFAT3抑制剂11R-VIVIT共处理心肌细胞，结果显示NFAT3蛋白表达水平较高糖与Alda-1共处理显著降低，而CaNAβ蛋白表达量却有所增高，但并无统计学意义。我们的研究结果表明高糖可激活心肌细胞内Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路，并推测该过程可被ALDH2有效拮抗。

因此，为了进一步验证上述猜测，我们通过检测ALDH2蛋白表达发现, 各组ALDH2蛋白表达与各组CaNAβ、NFAT3蛋白表达变化趋势相反，并且与各组细胞钙离子浓度和CaN浓度变化也呈相反趋势。在使用NFAT3特异性抑制剂11R-VIVIT后发现ALDH2蛋白表达量与无11R-VIVIT存在条件下并无明显差异，这些结果进一步证实了ALDH2可能作为Ca²⁺-CaN-NFAT3信号通路上游分子发挥调控作用。

综上所述，ALDH2可能通过下调Ca²⁺-CaN-NFAT3通路活性拮抗高糖引起乳鼠心肌细胞损伤。