胆管癌是一种高度恶性的胆道肿瘤，在世界范围内，胆管癌的发病率和死亡率逐年上升^[1-2]。目前尚缺乏有效的预防或治疗手段，手术仍然是唯一的治疗选择，但它仅有少数早期被诊断的患者具有手术治疗的机会^[3]。长期炎症、损伤和修复性胆管上皮细胞增生将会诱发胆管癌的发生。MicroRNAs（miRNAs）是一类大小20~22个核苷酸的非编码RNA，在转录后水平通过与靶mRNA结合参与基因表达的调控^[4-5]。miRNA在一些人类和动物肿瘤的发生发展过程中起关键作用，表现出极强的诊断价值和成药性^[6-7]。在多种人类肿瘤中，miR-29b通过靶向多种基因而影响细胞的增殖、侵袭和转移^[8-10]。miR-29在胆管癌细胞株KMCH中表达下调，通过调控Mcl-1影响细胞的凋亡^[11]。Okamoto等^[12]发现miR-29b与胆管癌细胞株HuH28对吉西他滨的耐药相关，过表达miR-29b可以显著增强细胞的药物敏感性。然而，miR-29b在胆管癌组织中的表达和对胆管癌细胞增殖的作用尚未见报道。鉴于近年来miRNA在蛋白质调控和肿瘤发生中的重要性，我们拟通过细胞功能学实验，同时结合胆管癌临床样本，探讨miR-29b对胆管癌细胞增殖、克隆形成、周期和凋亡的影响。

人胆管癌细胞株QBC939、良性胆管细胞株H69于37 ℃，5% CO₂恒温培养；DMEM, High Glucose培养基，FBS（GIBCO）；慢病毒LV-hsa-miR-29b及阴性对照慢病毒LV（吉凯基因）；实时荧光定量通用试剂（吉玛）；AnnexinV-APC/PI凋亡检测试剂盒（BD）。

手术切除胆管癌标本30例和正常胆管标本20例收集于贵州医科大学附属医院肝胆外科2015年7月~2017年7月间，液氮冻存，所有标本均经病理学诊断证实，均获患者知情同意。

扩增miR-29b片段并克隆至GV309载体的AgeI和EcoRI位点，构建重组载体LV-has-miR-29b，所使用的上游引物为：5'- GGAAAGGACGAAACACCGGCTAGGTTGTCTTG GGTTTATTG-3'，下游引物为：5'-TGTCTCGAGGT CGAGAATTAAAAAACTTCAGAGCTGTCCCATTC AC-3'。将LV-has-miR-29b转化到大肠杆菌中进行扩增，提取质粒。将LV-has-miR-29b以及病毒包装质粒（Helper 1.0和Helper 2.0）共转染293T细胞，转染48 h后收集上清液，5000 r/min离心10 min去除细胞沉淀，0.22 μm滤膜过滤后分装，-80 ℃保存。用梯度稀释法测定病毒滴度。miR-29b过表达组QBC939细胞的miR-29b较阴性对照组。

将对数生长期的QBC939细胞分为3组，空白对照组，阴性对照组，miR-29b过表达组。空白对照组细胞自然生长；阴性对照组和miR-29b过表达组，将含阴性对照和LV-hsa-miR-29b的慢病毒颗粒上清液分别体外感染QBC939细胞，感染48 h后，使用抗生素筛选48 h，荧光显微镜下观察阳性细胞，收集细胞汇合度70%~80%的生长状态良好的细胞进行下游实验。

利用TRIzol提取细胞和组织中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，按照TaqMan miRNA检测试剂盒说明书在Applied Biosystems 7900 HT上检测miR-29b的表达，采用2^-△△CT法检测，U6为内参对照。

MTT将处于对数生长期的各组细胞胰酶消化，制成细胞悬液，接种至96孔板（2×10³/孔），分别于24、48、72、96、120 h加入20 μL 5 g/L MTT，孵育4 h后离心去掉上清，加入DMSO 150 μL溶解结晶，测定吸光度A_{490 nm}。

将处于对数生长期的各组细胞胰酶消化，制成细胞悬液，接种至6孔板(500/孔)，每个实验组设3个复孔。培养到14 d或绝大多数单个克隆中细胞数大于50，中途每隔3 d进行换液并观察细胞状态。经多聚甲醛固定和GIEMSA染色，拍照记录克隆数。

各组细胞感染48 h后，胰酶消化，制成细胞悬液，离心弃上清，预冷PBS洗涤1次，离心弃上清，预冷的75%乙醇固定1 h，离心弃固定液，加入25 μL 0.5% PI染色液和10 μL 10 mg/mL RNase A，4 ℃避光染色30 min，上机检测。

各组细胞感染48 h后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，制成细胞悬液，在100 μL的Binding Buffer中加入5 μL AnnexinV-APC及5 μL的PI染液，混匀。室温避光反应15 min。再加入400 μL的Binding Buffer混匀，上流式细胞仪检测，统计细胞早期凋亡和晚期凋亡的百分比。

采用GraphPad Prism软件进行数据处理，结果以均数±标准差表示，采用t检验进行统计分析。以P < 0.05以为差异有统计学意义。

RT-PCR检测结果显示，在QBC939细胞中miR- 29b的表达低于H-69（3.77±0.30），差异具有统计学意义（P < 0.01，图 1A）。与正常胆管癌组织相比，miR-29b在胆管癌组织中表达降低（3.24±1.51），差异具有统计学意义（P < 0.01，图 1B）。

图 1(Figure 1)

图 1 miR-29b在胆管癌细胞和组织中的表达 Figure 1 Relative miR-29b expression in cholangiocarcinoma cells (A) and tissues (B). **P < 0.01 vs H-69 cells or normal tissues.

慢病毒载体感染QBC939细胞48 h后，在荧光显微镜下可以看出，感染组细胞出现较强的荧光（图 2A）。RT-PCR检测结果显示，miR-29b的表达在LV-hsa-miR- 29b感染组高于阴性对照组和空白组，差异具有统计学意义（P < 0.01），上调（791.15±20.30）倍（图 2B）。

图 2(Figure 2)

图 2 miR-29b转染效率的检测 Figure 2 Transfection efficiency of miR-29b. A: Representative fluorescence images of the cells after transfection (Original magnification: × 100); B: Relative miR-29b expression detected by RT-PCR. **P < 0.01 vs control or NC. Control NC LV-hsa-miR-29b 1000 800 600 400 200 0 Rel

MTT结果显示，过表达miR-29b后，QBC939细胞的增殖能力减弱，与阴性对照组和空白组相比，在96 h和120 h差异均具有统计学意义（P < 0.05，图 3A）。如图 3B所示，过表达miR-29b的胆管癌细胞株QBC939形成的克隆数为64±8，而空白对照组与阴性对照组分别为198±7和162±10。细胞克隆形成实验显示，过表达miR-29b可以显著减少QBC939细胞的克隆形成数，而阴性对照组和空白组之间差异具无显著统计学意义。

图 3(Figure 3)

图 3 过表达miR-29b显著抑制QBC939细胞的增殖和克隆形成 Figure 3 Overexpression of miR-29b inhibits QBC939 cell proliferation and clone formation. A: Cell proliferation was detected by MTT assay; B: Cell clone formation assay. *P < 0.05 vs control or NC, **P < 0.01 vs control or NC.

流式细胞术分析发现，过表达miR-29b显著改变了细胞周期的分布，过表达miR-29b显著改变了胆管癌细胞株QBC939周期的分布，与阴性对照组和空白细胞比较，LV-hsa-miR-29b组细胞S期比例降低，为（21.27 ± 0.34）%，G₂/M期比例减少，为（8.05±0.27）%，而G₁期比例增高，为（70.68±0.49）%，故过表达miR-29b可使胆管癌细胞QBC939阻滞在S期，与阴性对照组和空白组比较，差异具有显著性统计学意义（P < 0.05，图 4A）。Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况，LV-hsa-miR- 29b组细胞凋亡率明显增加，与阴性对照组和空白组之间差异有统计学意义（P < 0.01），空白组和阴性对照组之间差异无统计学意义（图 4B）。

图 4(Figure 4)

图 4 过表达miR-29b阻滞QBC939细胞于S期和诱导细胞的凋亡 Figure 4 Overexpression of miR-29b blocks cell cycle at the S phase and induces cell apoptosis. A: Overexpression of miR-29b increases G1 phase cells and reduces G2/M phase cells; B: Overexpression of miR-29b induces cell apoptosis shown by flow cytometry. *P < 0.05 vs control or NC, **P < 0.01 vs control or NC.

胆管癌恶性程度高，手术切除率低且复发率高，病人预后较差^[1-3]。胆管癌的发生是一种多基因多因素共同作用的结果，其发病机制复杂，涉及许多分子和信号级联的改变，如Wnt/β-catenin，PI3K/Akt /mTOR，Notch信号通路等^[13-16]。随着对胆管癌发病机制的研究深入，肿瘤生物靶向治疗为广大胆管癌患者的治疗带来了新的希望，生物靶向治疗可以部分弥补传统手术治疗、放化疗的不足之处，在一定程度上改善肿瘤患者的预后^[17]。因此，深入研究胆管癌发病的分子机制和寻找新的治疗靶点，将为胆管癌的靶向治疗提供新的策略。

在大部分哺乳动物中，miRNAs通过不完全互补导致靶mRNA翻译受到抑制，而在大部分植物中，miRNA能与靶mRNA完全互补使其发生降解。miRNA在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，特别是在肿瘤中引起越来越多的关注^[18-20]。有研究发现褪黑激素通过上调miR-526b-3p和miR- 590-5p通过靶向SMAD7增强SMAD1磷酸化而促进人类骨髓间充质干细胞成软骨分化^[21]。研究表明由前列腺癌细胞分泌的miR-149-3p可诱导受体血管内皮细胞中的DAB2IP下调，刺激其增殖和迁移^[22]。目前，多个miRNA已经进入临床试验阶段，如miR-34 ^[23]，miR-122 ^[24]。因此，miRNA不仅可以成为胆管癌新型的生物标志物，进一步研究特异性表达的miRNA可以为胆管癌的临床治疗提供新的研究方向。

miRNA可以通过靶向作用于不同的目标基因，影响肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭和耐药等。如miR-1246在前列腺癌临床组织和细胞系中下调，并选择性释放到外泌体中，过表达miR-1246可显著抑制体内异种移植肿瘤生长，增加体外细胞凋亡并降低增殖，侵袭和迁移^[25]。同样，miR-26b在肝癌细胞中表达降低，并且能够抑制细胞上皮-间质转化^[26]。许多miRNA表现出双重的作用，即抑癌miRNA和原癌miRNA。在既往的研究中，miR-29b被证实可以靶向MCL1，BCL2，AKT2，CCND2和CDC42促进癌细胞的凋亡，靶向DNMT3A和DNMT3B抑制细胞的增殖与转移^[27]。另一方面，在胃癌细胞中miR-29b可以靶向KDM2A抑制癌细胞的增殖与转移^[28]。以上研究表明，miR-29b参与多种肿瘤的发生发展，并且在不同肿瘤中发挥不同的作用，而在胆管癌中，目前的研究仅限于胆管癌细胞株，且其对胆管癌细胞增殖、克隆形成、周期和凋亡的影响缺乏相关研究。

为探讨miR-29b在胆管癌中的生物学功能，我们采用Realtime-PCR对胆管癌细胞和组织进行定量分析，发现miR-29b与胆管癌的发生相关，其在胆管癌细胞和组织中表达明显低于正常胆管细胞和组织；除此之外，为分析miR-29b在胆管癌进程中的生物学功能，我们构建了慢病毒载体过表达LV-hsa-miR-29b，在QBC939细胞中，通过MTT实验和克隆形成实验，证实过表达miR-29b可以明显抑制胆管癌细胞的增殖和克隆形成。流式细胞术结果显示，与对照组相比，过表达miR-29b可以显著诱导细胞的凋亡，同时可使细胞周期阻滞于S期。以上证据表明，miR-29b在胆管癌中是一种抑癌miRNA。这与Zhao等^[29]报道的内容相似，miR-29b可作为抑癌因子，抑制乳腺癌细胞的增殖。但miR-29b在胆管癌中的作用机制尚不明了。有研究显示miR-29b通过靶向作用Akt3抑制血管生成和肿瘤发生，从而抑制肿瘤增殖；同时也可抑制炎症细胞，联合发挥抗肿瘤作用^[30]。

综上所述，本研究表明miR-29b在胆管癌中低表达，过表达miR-29b可以显著抑制胆管癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，发挥着抑癌miRNA的作用，miR-29b有望为胆管癌患者的靶向治疗提供新的策略。