肝细胞肝癌(HCC)的高复发率和死亡率与肝癌细胞的转移侵袭密切相关，丰富的血液供给为肝癌细胞的转移侵袭提供了可能。血管生成拟态(VM)是一种区别于经典的肿瘤血管生成途径，不依赖血管内皮细胞的肿瘤微循环模式。目前在食管癌、卵巢癌、胆囊癌、肝癌等中证实存在VM，且存在VM的肿瘤细胞恶性程度高、侵袭能力强，易发生转移^[1-5]。VM理论为恶性肿瘤血供方式提供了新的思路，也成为恶性肿瘤转移侵袭机制的研究热点。

Rho/ROCK信号通路与恶性肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移等多种生物学行为有关，该信号通路的活化促进了肝癌细胞的转移和侵袭^[6-8]。目前对于Rho/ROCK信号通路与肿瘤VM形成相关性的研究较少，已有的结果提示通过抑制该通路信号分子RhoA、ROCK的表达能够抑制肿瘤VM的形成^[9-11]。血管上皮钙黏素(VEcadherin)和磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)目前被认为是VM形成的关键通路蛋白，有研究证实通过Rho/ROCK通路的活化，能够促进VE-cadherin、PI3K的表达^[12]。

鳖甲煎丸出自《金匮要略》，具有益气养血、活血化瘀、解毒散结之效，目前广泛应用于肝癌、肝硬化和肝纤维化等疾病的治疗^[13-15]。我们前期的研究表明鳖甲煎丸能够有效抑制肝癌HepG2细胞的转移侵袭^[16-18]，但其作用机制尚不明确。本研究首次以三维培养的肝癌HepG2细胞为模型，运用血清药理学方法，观察鳖甲煎丸对肝癌细胞VM形成的作用，以及鳖甲煎丸对Rho/ROCK信号通路和VE-cadherin、PI3K表达的影响，探讨鳖甲煎丸对肝癌HepG2细胞VM形成的影响及其分子机制。

鳖甲煎丸，产自国药集团中联药业有限公司(50 g/瓶)，国药准字Z42020772。

雄性SD大鼠(6周龄)40只，平均体质量250 g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物许可证编号为SCXK(粤)2011-0015。肝癌细胞系(HepG2)：由南方医科大学药学院抗病毒中心提供。

DMEM高糖培养液、PBS缓冲液系Hyclone产品；胎牛血清、青链霉素混合液(双抗)、0.25%胰蛋白酶购自GIBCO；Y-27632购于MedChemExpress；兔抗人ROCK1单克隆抗体、兔抗人RhoA单克隆抗体购自Abcam；I型胶原蛋白、10% SDS、Tris碱、Tween 20购自Sigma；二甲基亚砜(DMSO)系MP原装；SYBR^® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)，Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H)购于TAKARA；ELISA Kit购于Andygene。

将大鼠随机分组为鳖甲煎丸高(H组)、中(M组)、低剂量组(L组)及生理盐水阴性对照组(N组)，10只/组。以成人(60 kg)临床剂量换算得大鼠(250 g/只)的药物剂量为1.1 g/kg(设为M组)。H和L组分别为M组的2倍和0.5倍，用生理盐水配置为混悬液，按8 mL/kg灌胃给药。N组按等体积的生理盐水处理。大鼠灌胃2次/d，灌胃4 d后大鼠用3% 1.0 mL/kg异戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉采血，4 ℃静置4 h，3000 r/min离心20 min，分离血清，56 ℃水浴中灭活30 min，0.22 μm微孔膜过滤，-80 ℃冷藏备用。

于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度条件下将HepG2细胞培养在高糖DMEM培养基内(含10%胎牛血清、5%双抗)，隔天换液。待细胞密度长至80%时，用不含血清的高糖DMEM培养基换液进行饥饿处理，继续培养24 h，制备细胞悬液并在显微镜下计算细胞密度。另取24孔培养板，每孔加入25 μL的Matrigel原液，37 ℃培养箱内温育60 min，待胶凝固后，再向每孔添加1 mL密度为8×10⁵/mL的细胞悬液。

待细胞密度长至80 %时，用不含血清的高糖DMEM培养基换液进行饥饿处理，继续培养24 h后，分别加入鳖甲煎丸高(H)、中(M)、低剂量(L)，阴性对照(N)药物血清以及含Y-27632(50 μmol/L)的对照血清(P)^[19]，设置分组为：H组、M组、L组、N组、P组。

以上各组细胞在37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h后，在40倍光镜下观察并用Kodak Image Station 2000 MM成像系统拍摄记录各组VM管道形成情况，测量照片中血管样结构的长度(认为长度>200 μm为血管样结构)，并计算每张照片的总长度^[20]。实验重复3次，计算平均值。

将各实验组回收的细胞裂解、提取总蛋白，待样品总蛋白定量后，将样品与5×的上样缓冲液4: 1混合，100 ℃煮沸5 min变性，按每孔总蛋白30 μg进行10% SDSPAGE凝胶电泳(80 V 20 min，120 V 100 min)，将蛋白转至PVDF膜(300 mA 80 min)，使用5 %脱脂牛奶室温封闭1 h，封闭后的PVDF膜在一抗中孵育过夜(4 ℃)，TBST洗涤3次，随后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育2 h，TBST洗涤3次，ECL发光试剂盒在曝光仪中进行曝光，以内参GAPDH为对照，实验重复3次。采用Image J软件进行灰度分析。

收集细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒检测各组VE-cadherin、PI3K的表达，每例样本均设3个复孔，求其均值，所有标本均为同批检测，均值为最终浓度。

各组VM管道形成情况采用Image J软件采集灰度分析数据，应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。实验数据采用独立样本t检验、单因素方差分析评价，P < 0.05为差异有统计学意义。

在相同培养条件下，将肝癌细胞三维培养24 h后在40倍光镜视野下随机截取20个视野，H组在VM管道数量以及血管样结构数量上要低于M、L和N组，但其在VM管道数量/血管样结构数量比值上则要高于M、L和N组。H，M和L组VM管管径远大于N组，差异具有显著性(P < 0.01)P组无明显VM管道形成(P < 0.01，图 1~2，表 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 各组三维培养细胞图 Figure 1 Three-dimensional culture of different drug groups (Original magnification: ×40). A: Normal group; B: Lowdose group; C: Middle-dose group; D: High-dose group; E: Positive-dose group.

图 2(Figure 2)

图 2 VM管道数量/血管样结构数量比值 Figure 2 Ratio of vasculogenic mimicry to vascular structure. N: Normal group; L: Low-dose group; M: Middle-dose group; H: High-dose group; P: Positive-dose group.

表 1(Table 1)

表 1 不同药物浓度组血管样管道数量比较 Table 1 Comparison of the number of vascular-like pipes in different drug level groups Group N L M H P Number of VM pipes 164 314 350 182 0 Number of vascular structures 263 365 410 204 979 N: Normal group; L: Low-dose group; M: Middle-dose group; H: High-dose group; P: Positive-dose group.

表 1 不同药物浓度组血管样管道数量比较 Table 1 Comparison of the number of vascular-like pipes in different drug level groups

实验结果表明，和N组相比，各药物血清组对三维培养的HepG2细胞中RhoA及ROCK1的蛋白表达水平有均抑制作用(P < 0.05，图 3，表 2)。

图 3(Figure 3)

图 3 鳖甲煎丸对三维培养的HepG2细胞中RhoA、ROCK1表达的影响 Figure 3 Effect of Biejiajian Pills on expression of RhoA and ROCK1 in HepG2 cells in three-dimensional culture. N: Normal group; L: Low-dose group; M: Middle-dose group; H: High-dose group; P: Positivedose group.

表 2(Table 2)

表 2 鳖甲煎丸对三维培养的HepG2细胞中RhoA及ROCK1表达的影响 Table 2 Effect of Biejiajian Pill on expression of RhoA and ROCK1 in HepG2 cells in three-dimensional culture Group Group quantity RhoA ROCK1 N 3 0.70±0.14 0.83±0.08 L 3 0.53±0.12 0.70±0.03* M 3 0.36±0.06* 0.57±0.05* H 3 0.25±0.01* 0.44±0.08* P 3 0.22±0.07* 039±0.09* Compared with the the normal group, *P < 0.05 N: Normal group; L: Low-dose group; M: Middle-dose group; H: High-dose group; P: Positive-dose group.

表 2 鳖甲煎丸对三维培养的HepG2细胞中RhoA及ROCK1表达的影响 Table 2 Effect of Biejiajian Pill on expression of RhoA and ROCK1 in HepG2 cells in three-dimensional culture

和N组相比，H、M、L、P组的VE-cadherin、PI3K表达水平均显著降低(P < 0.05)，表明各组药物血清对三维培养的HepG2细胞中VE-cadherin、PI3K的表达均有抑制作用(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 各组PI3K、VE-cadherin的表达水平 Table 3 Expression of PI3K and VE-cadherin in different groups (n=3, Mean±SD) Group PI3K (pmol/L) VE-cadherin (ng/L) N 166.7±5.6 1514.6±138.8 L 132.7±11.5* 1291.5±68.8* M 122.5±9.8* 1285.3±124.0* H 99.1±10.8* 1068.7±99.0* P 86.9±12.1* 872.1±95.2* Compared with the the normal group, *P < 0.05 N: Normal group; L: Low-dose group; M: Middle-dose group; H: High-dose group; P: Positive-dose group.

表 3 各组PI3K、VE-cadherin的表达水平 Table 3 Expression of PI3K and VE-cadherin in different groups (n=3, Mean±SD)

有研究发现HCC患者术后癌组织存在VM^[4-5]，随后的体内、外实验^[21]也证实HCC中存在VM，且VM与肝癌的侵袭转移能力正相关。VM的发现有助于解释HCC高侵袭、高转移的生物学行为，更为HCC抗血管治疗提供新的理论依据和治疗靶标；但目前对于肝癌VM的研究很少，其相关机制仍需深入探讨。中医认为，肝癌转移病机复杂，累及多系统、多组织、多器官，寒热交错，虚实夹杂。鳖甲煎丸组方寒热并用，攻补兼施，具有益气养血、活血化瘀、解毒散结之效，该方已成为抗肿瘤领域中一个极具研究潜质的方药。

我们研究发现当不同剂量的鳖甲煎丸作用于三维培养的肝癌HepG2细胞之后，H组在VM管道数量以及血管样结构数量上要低于N、L、M组，但VM管径远高于其他组。这一结果提示我们鳖甲煎丸不但可以抑制VM和血管样结构的数量，而且可能通过抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡的方式扩大了VM的生存空间，进而增大了VM的管径^[22]。

RhoA和ROCK1作为Rho/ROCK信号通路的重要信号分子，参与了细胞骨架运动，细胞黏附及细胞周期等多个环节，已有研究证实上述分子的活化可以促进肝癌的侵袭转移^[23-25]。目前关于Rho/ROCK信号通路与肿瘤VM的报道很少，在对B16小鼠黑色素瘤细胞VM生成的研究中发现RhoA起到促进的关键作用^[10]；对人类骨肉瘤(OS)细胞^[9]和肝癌细胞的研究中发现ROCK是肿瘤细胞形成VM关键因子。Y-27632作为Rho/ ROCK信号通路的抑制剂，已被证实不仅能够抑制肝癌细胞的生长和转移，还可以抑制肝癌VM的形成^[26-27]。本研究发现，50 μmol/L的Y-27632通过降低RhoA和ROCK1的表达几乎完全抑制了HepG2细胞VM的形成，说明Rho/ROCK信号通路在肝癌VM的形成过程中发挥了重要作用。不同剂量的鳖甲煎丸都能抑制RhoA和ROCK1的表达，表明鳖甲煎丸能够通过调控RhoA和ROCK1的表达，从而抑制Rho/ROCK信号通路的活化，进而抑制了肝癌细胞VM的形成。

缺氧可以促进恶性肿瘤VM的形成，这一现象在HCC患者的癌组织中也得到了证实^[28]。缺氧激活缺氧诱导因子，上调VE-cadherin等的转录，诱导受体酪氨酸激酶(EphA2)重新定位到细胞膜，导致EphA2磷酸化。被激活的EphA2使局部黏着斑激酶磷酸化，从而激活细胞外信号调节激酶(ERK1/2)，进而激活PI3K。PI3K能同时被VE-cadherin与EphA2激活。被激活的PI3K调控基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)前基因转换成MT1-MMP，从而激活MMP-2前基因。MT1-MMP和MMP-2共同促进了层黏连蛋白(LN-5γ2)链裂解成片段。细胞外微环境中增多的这两种片段最终导致VM的形成^[29]。所以VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMP信号通路目前被认为是VM形成的关键通路。有研究发现RhoA可以通过PI3K/Akt通路促进小鼠前列腺癌细胞增生^[30]；PPARγ通过上游调控分子RhoA/ROCK经PTEN/PI3K/Atk信号通路调控下游VEGF表达，参与胃癌的发展和转移^[12]；Y-27632可以抑制肝癌细胞中VEcadherin和PI3K的表达^[27]。上述研究提示Rho/ROCK可能是VE-cadherin/PI3K的上游信号通路，通过调控VE-cadherin/PI3K的信号分子发挥作用。本研究也发现鳖甲煎丸能够抑制三维培养的肝癌细胞HepG2细胞中VE-cadherin、PI3K的表达，这可能与鳖甲煎丸能够抑制Rho/ROCK信号通路的活化，从而调控下游VEcadherin、PI3K的表达水平有关。

综上所述，我们首次以三维培养的肝癌HepG2细胞为研究对象，发现鳖甲煎丸可以抑制肝癌细胞VM的形成，从而达到抗肝癌转移侵袭的目的，其分子机制可能与抑制Rho/ROCK通路信号分子RhoA、ROCK1的表达，进而抑制VE-cadherin、PI3K的活化有关。这一结果为鳖甲煎丸抗肿瘤转移侵袭的机制研究提供了新的思路。