据世界卫生组织统计，癌症是全球死亡的主因，而肺癌是癌症相关性死亡的最主要原因^[1]。肺癌的发生发展基于多种遗传学和表观遗传学方面的变化，受到多个基因、因子的调控^[2-3]。研究发现泛素-蛋白酶体系统（UPS）在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用^[4-6]。去泛素化酶是泛素化修饰过程中一种能逆转泛素化修饰的关键酶，它在肿瘤进展过程中的新功能、新机制一直是肿瘤研究中的重点。USP33是泛素特异性蛋白酶的一种，我们实验室采用免疫组化、Real time-PCR以及Western blot检测其在肺癌组织中表达情况，发现，在肺腺癌组织中USP33表达明显下调，对抑制肺癌的增殖和迁移侵袭的机制未进行研究，国内外均未见报道。本实验室以肺腺癌细胞系为研究对象，把USP33沉默以后，研究其对细胞增殖、迁移侵袭的影响以及通过SLIT2/ROBO1信号通路抑制肺腺癌细胞增殖和侵袭转移。

A549细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），SPC-A-1、H1299、PC9、人肺支气管正常上皮细胞16HB细胞由南方医院中心实验室馈赠。RPMI 1640培养基（Hyclone），四季青胎牛血清（Gibco），TRIzol Kit (Takara)，SYBR Green PCR master mix (Roche)；Lipofectamine 2000 reagents (Invitrogen)，Opti-MEM（Invitrogen）；PVDF膜（Bio-rad）一抗anti-USP33（Abcan）；一抗anti-SLIT2 and ROBLO1（Cell Signaling Technolog），β- tubulin (Proteintech Group)；二抗goat anti-rabbit（invitrogen）；Transwell inserts（Corning），USP33的沉默序列（锐博生物），IL6刺激因子（selleck）。

2017年3月~6月在南方医院胸外科收集20对原发性肺腺癌Ⅰ期和Ⅱ期癌组织及其相应的癌旁组织标本。所有患者均未接受过放疗或化疗，本研究经南方医科大学南方医院伦理审查委员会批准。手术中取出所有标本，立即储存于-80 ℃中。

所有细胞由10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。保持在37 ℃、饱和湿度及5% CO₂的培养箱中传代培养。

3条靶序列，3条靶序列si-h-USP33-001 CCTCAGAACATTTGGGATA si-USP33-002 CAGCTCAAATTGTGACATA si-h-USP33-003 GAGAAGATGTGCAATAAGA，阴性对照siRNA序列为锐博公司专有。将A549、SPC-A-1细胞按照20万/孔接种于6孔板上，过夜细胞贴壁后换液，参照Lipofectamine2000说明书的方法将各组siRNA序列分别转染至A549、SPC-A-1细胞中，终浓度达到100 nmol，同时以非特异性siRNA作为阴性对照组（NC组），每组设3个复孔，72 h后提取全蛋白，采用Western blot检测USP33的表达。

使用Trizol试剂盒根据制造商的说明从细胞系或组织提取总RNA。使用Takara RT试剂合成cDNA。使用SYBR Green PCR master mix试剂盒在Light Cycler 480系统上进行qRT-PCR实验。我们使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。

通过10% SDS-PAGE分离等量的蛋白质并印迹到用一抗兔抗人SLIT2、ROBO1、β- tubulin、兔抗人USP33和荧光山羊抗兔二抗的PVDF膜（Millipore）上。一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温下孵育1 h，Western blot检测系统测定目的蛋白的表达水平。

当细胞长到约90%汇合（48 h后）时，用10 μL移液器尖端产生人造伤口。将细胞在不含血清的新鲜培养基中培养。在0 h和36 h拍摄图像以观察伤口愈合。使用以下公式计算伤口愈合的相对百分比：（伤口宽度0 h-伤口宽度36 h）/伤口宽度0 h。

使用transwell小室在24孔板中评估细胞的迁移和侵袭能力。对于侵袭测定，将每组细胞（5×10⁴/100 μL）重悬浮于不含血清的RPMI 1640培养基中，并接种至含有基质胶涂覆的膜的上室中。在培养箱中孵育24 h后，用棉签从培养基的上表面除去孵育培养基和非侵入细胞。将粘附于腔室下表面的侵入细胞在4%多聚甲醛中固定20 min，并用0.1%结晶紫染色30 min。使用显微镜以200倍放大率对浸染细胞进行照相并手动计数。对于transwell迁移测定，过程是相同的。每个测定至少独立进行3次。

按照烤片、脱蜡、切片、水化、抗原修复等步骤操作进行免疫组化，结果判定USP33阳性反应均为细胞和（或）胞浆深黄色或棕黄色染色，在400倍镜下随机挑取5个视野，采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。免疫组化评分标准：染色深度共分为0分（无色）、1分（淡黄色）、2分（黄色）、3分（棕黄色），每种染色所占面积则依照0分（无细胞染色）、1分（25%染色）、2分（50%染色）、3分（75%染色）及4分（100%染色）。然后染色深度评分和对应的染色面积评分相乘后相加，既得到了最后的染色评分。其中0~2分定义为阴性表达，3~7分定义为弱阳性表达，8~12分定义为强阳性表达。

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，实验数据中正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较使用t检验，P < 0.05认为差异具有统计学意义。

与16HBE正常肺上皮细胞相比，USP33在A549，SPC-A-1，H1299和PC9肺癌细胞系中呈不同程度表达下调（图 1A），USP33在SCP-A-1细胞系中表达下调最明显而在A549细胞系下调程度最小。qRT-PCR结果显示癌旁组织中USP33的平均表达水平比相对应的癌组织高（P < 0.001，图 1B）。利用免疫组化分析了10例肺腺癌患者癌组织和匹配的癌旁组织USP33的表达，试验结果与qPCR结果一致，10例癌组织中USP33都被证明是低表达。无倾向任意选取其中两例作为代表，癌组织0分，为阴性表达，而癌旁为强阳性表达（图 1C）。同时，这与我们通过TCGA数据库分析USP33生存预后相一致，USP33高表达生存预后较好（图 1D）。

图 1(Figure 1)

图 1 USP33在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达与生存预后的关系 Figure 1 Expression of USP33 in NSCLC tissues and cell lines and its association with the survival and prognosis of the patients. A: The expression levels of USP33 were analyzed in various lung cancer cell lines. B: The expression of miR-365 in lung adenocarcinoma tissues. C: Immunohistochemistry showed that USP33 was lowly expressed in lung adenocarcinoma (Original magnification: ×400). D: Survival analysis. ***P < 0.001.

USP33-si-1、USP33-si-2转染可显著下调A549、SPC-A-1细胞中USP33蛋白的表达水平（P < 0.05），说明沉默序列可以抑制USP33的表达（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 沉默序列转染A549、SPC-A-1细胞系后USP33的表达 Figure 2 Expression of USP33 after transfection in A549 and SPC-A-1 cells.

细胞划痕实验结果显示，USP33沉默后可明显促进A549、SPC-A-1细胞的迁移，相较于阴性对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 USP33沉默后对肺癌细胞迁移的影响 Figure 3 Wound healing assay of A549 and SPC-A-1 cells transfected with USP33-si-1, USP33-si-2 or the control siRNA. All experiments were performed in triplicate and repeated for 3 times. **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

Transwell迁移和侵袭实验结果显示，USP33沉默后A549和SPC-A-1细胞迁移和侵袭力明显增加，与阴性对照组相比，结果均具有显说明USP33可抑制肺癌细胞的迁移和侵袭（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 USP33沉默后对肺癌细胞迁移侵袭的影响 Figure 4 Transwell migration and invasion assay of A549 and SPC-A-1 cells transfected with USP33-si-1, USP33-si-2 or the control siRNA. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control.

与阴性对照组相比，在A549和SPC-A-1细胞中沉默USP33后SLIT2和ROBO1蛋白表达均下调（图 5）。

图 5(Figure 5)

图 5 Western blot检测SLIT2/ROBO1通路蛋白的变化 Figure 5 Western blotting for detecting SLIT2 and ROBO1 expressions in A549 and SPC-A-1 cells following USP33 silencing.

侵袭转移是肺癌难以根治的主要原因，探讨肺癌转移机理并找到阻断转移的方法，是目前国际医学界研究的热点^[7-8]。去泛素化酶在肿瘤进展中起到的作用逐步受到重视，其调控的分子机制也逐步明确，已有超过40种去泛素化酶被发现与肿瘤的发生、发展有关^[9-16]。如USP22可以与目标底物相互结合，水解相应的多聚或单泛素标签，从而稳定目标底物蛋白或是影响底物蛋白对下游分子的调节作用。目前已经在不同的细胞中发现了并证实了数种能与USP22直接相互作用的目标底物蛋白，包括Sirt1、TRF1、FUBP1、RCAN1、NFATc2以及AR等^[17-22]。在临床应用方面，硼替佐米是第一个被临床认可的UPS抑制剂，用于治疗B细胞淋巴瘤及多发性骨髓瘤，是UPS作为治疗靶点的重要范例^[23]。另一个蛋白酶体抑制剂卡非佐米在2012年被FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗^[24]。而对于USP33的研究，目前研究较少，USP33可通过与CP110在细胞周期S/G2及G2/M期的相互作用，维持CP110的稳定，拮抗cyclin-F的作用，维持中心粒的稳态，保证细胞有丝分裂的正常进行和基因组稳定性，减少肿瘤发生^[9]。

我们通过免疫组化发现USP33在肺腺癌组织和细胞中低表达，TCGA数据库分析与肺癌患者生存预后紧密相关，通过功能试验验证了USP33可抑制肺癌细胞的迁移侵袭的能力，进而，我们又提出了针对USP33通过什么机制抑制肺腺细胞迁移侵袭进行了解答。

SLIT/ROBO信号通路较早是在中枢神经系统中进行研究的，其在中枢神经系统中有抑制神经细胞迁移，阻止合缝处神经轴突穿过神经管中线，控制神经轴突在神经系统中准确定位的作用。Prasad等^[25]在几种乳腺癌细胞系中发现有ROBO1、ROBO2的表达，并且SLIT2可抑制CXCL12/CXCR 4诱导的乳腺癌细胞趋化、侵袭、粘附作用以及MMP-2和MMP-9的分泌, 表明SLIT/ROBO信号能够抑制乳腺癌细胞迁移。SLIT/ ROBO在卵巢癌细胞系可通过激活半胱天冬酶-3诱导程序性细胞凋亡，SLIT2、SLIT3或ROBO1蛋白在小鼠乳腺癌模型中的缺失导致组织损伤修复增加，细胞增殖数量增加，刺激上皮中SDF1-CXCR4轴，表明SLIT/ROBO信号能够抑制卵巢癌细胞、乳腺癌细胞增殖^[26-29]。以上说明SLIT/ROBO信号通路可抑制肿瘤细胞迁移侵袭。我们发现沉默USP33后SLIT2、ROBO1表达下调，结合以上体外试验结果，我们得出结论，USP33在肺腺癌组织和肺癌细胞系中表达下调，抑制USP33可促进肺癌细胞增迁移侵袭的能力。USP33作为抑癌基因很大可能参与到SLIT2/ROBO1信号通路，至于如何参与到SLIT2/ROBO1信号通路对肺癌的发生发展产生的影响，有待后续研究证明。同时，为了验证USP33的功能，在实验中我们用多种刺激因子刺激USP33，利用WB和qPCR实验，观察A549和SPC-A-1细胞，发现IL6刺激48 h后，IL6刺激组USP33蛋白的表达量明显增加。以上说明IL6在肺癌的发生发展中与USP33密切相关。已知在NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移、血管形成中炎症因子IL-6均发挥作用^[30-32]。作为功能因子IL-6与USP33的是如何相互发挥作用，需更为完整的机制进一步证实。