结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球居第3位^[1]。随着生活质量的提高及饮食习惯的改变，近年来结肠癌的发病率及死亡率呈现上升趋势^[2-3]，据统计，其5年生存率仅约50%^[4]。手术、放疗、化疗、分子靶向治疗等是目前治疗结肠癌的主要方式，而肿瘤免疫治疗有望成为新的治疗手段^[5-6]。

近来研究发现，细胞因子中的白细胞介素-9（IL-9）具有强大的抗肿瘤作用^[7]，如IL-9可明显降低小鼠黑色素瘤的增长速度，且可减少肺转移灶数量^{[8, 22-23]}；IL-9亦可抑制小鼠鳞癌的生长^[9]；此外，IL-9可促进CTL细胞抗原的启动并进入肺癌组织发挥抗肿瘤作用^[10]。IL-9在结肠癌患者的血浆及癌组织中低表达，且与结肠癌进展相关^[11]。对于IL-9的表达与结肠癌患者的临床病理特征及生存时间之间的关系，尚未有进一步研究。本研究通过免疫组织化学SP法及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测IL-9在结肠癌组织及相应癌旁正常组织中的表达水平，探讨其与结肠癌临床病理特征及预后之间的关系。

收集2010年1月~2010年12月苏州大学附属第一医院行手术切除的92例结肠癌组织标本及相应的癌旁正常组织标本（距肿瘤边缘5 cm以上，经术后病理证实无癌组织侵犯的结肠组织），所有组织标本留存两份：其中1份予以10%甲醛溶液（福尔马林溶液）固定，石蜡包埋、切片存档；另一份-80 ℃冰箱冻存，备抽提RNA。同时收集该92例患者完整的临床资料。所有患者均无自身免疫性疾病及结核、肝炎、艾滋病等传染病史，术前均未行放、化疗、靶向治疗及免疫治疗，术后病理均确诊为结肠癌。其中男性53例，女性39例；年龄46~91岁，平均年龄70.1岁；肿瘤直径≤3 cm 17例，> 3 cm 75例；低或中分化癌69例，高分化癌23例；根据第7版美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌TNM分期标准：Ⅰ~Ⅱ期44例，Ⅲ~Ⅳ期48例；根据Ducks分期标准：A~B期51例，C~D期41例；有淋巴结转移45例，无淋巴结转移47例；有肝转移6例，无肝转移86例。

石蜡切片，脱蜡水化，PBS洗片，柠檬酸缓冲液冲洗；3%的H₂O₂滴于组织切片，室温下放置灭活内源性过氧化物酶10 min，PBS再次洗片，去除PBS并滴加5% BSA 50 μL，室温孵育10 min；滴加IL-9一抗（1：200稀释）4 ℃过夜，PBS洗片；加二抗室温60 min静置，PBS再次洗片；DAB显色剂反应5 min，苏木精复染，梯度浓度乙醇脱水，中性树脂封片观察。IL-9抗体购于Abcam。

IL-9主要表达于细胞质，遂以细胞质出现淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。随机观察10个200倍镜视野，按阳性细胞所占比例计分：< 5%为0分，5%~30%为1分，31%~60%为2分，> 60%为3分；按染色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性染色细胞比例与染色强度相乘：< 2分为IL-9表达阴性（-），≥2分为IL-9表达阳性（+）。

加1 mL Trizol研磨组织标本至均质，转至1.5 mL无酶EP管并加入氯仿离心后，取上清液加入等体积异丙嗪，离心后弃上清液，加入75%乙醇，待酒精完全挥发后加入RNase-Free H₂O₂溶解RNA，适当稀释后用紫外分光光度计测定RNA A_{260 nm}和A_{280 nm}，判断RNA纯度，并调整样本RNA终浓度至同一水平。

使用Prime Script RT Master试剂盒，计算反应体系所需试剂剂量，加样后行逆转录反应，反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，4 ℃ 1 min，最终RNA逆转录成cDNA。

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，进行PCR扩增。根据仪器自动计算所得每组标本的Ct值，计算目的基因mRNA的相对表达量2^-ΔΔCt，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct，△Ct=目的基因Ct值-内参Ct值。引物序列如下：IL-9: F: 5'-CTCTGTTTGGGCATTCCCTCT-3'，R: 5'-GGGTATCTTGTTTGCATGGTGG-3'；GAPDH F: 5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，R:5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

随访时间为6~72月，截止至2016年12月1日。生存时间为患者手术当日至随访截止日期或至患者死亡日期；术后2年内每3月随访1次，术后2~5年每半年随访1次，术后5年以上每1年随访1次；随访通过电话、复诊等方式进行。

应用SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料采用率表示，不同组间的比较采用卡方检验，正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，应用GraphPad Prism 7.0统计软件绘制生存曲线，并采用Kaplan-Meier及Log-rank检验进行生存分析，P < 0.05为差异具有统计学意义。

免疫组织化学染色结果显示：结肠癌组织中IL-9阴性表达58例，阳性表达34例，阳性率为37.0%（34/92）；癌旁组织中IL-9阴性表达21例，阳性表达71例，阳性率为77.2%（71/92）。结肠癌组织中IL-9的阳性表达率明显低于癌旁正常组织，且差异具有统计学意义（P < 0.001，图 1、表 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 结肠癌组织和癌旁正常组织中IL-9蛋白的表达 Figure 1 Expression of IL-9 protein in colon cancer tissues and adjacent normal tissues (SP×100). A: Negative expression of IL-9 in colon cancer tissues; B: Positive expression of IL-9 in colon cancer tissues; C: Negative expression of IL-9 in adjacent normal tissues; D: Positive expression of IL-9 in adjacent normal tissues.

表 1(Table 1)

表 1 IL-9在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达 Table 1 Expression of IL-9 in colon cancer tissues and adjacent normal tissues (n=92) Tissue IL-9 expression (%) χ2 P - + Tumor tissues Normal tissues 58 (63.0) 21(22.8) 34 (37.0) 71(77.2) 30.367 0.000

表 1 IL-9在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达 Table 1 Expression of IL-9 in colon cancer tissues and adjacent normal tissues (n=92)

设癌旁组织IL-9 mRNA表达量均值为1。则癌旁正常组织IL-9 mRNA相对表达量（1.00±0.13）与结肠癌组织（0.32±0.09）相比，癌旁正常组织中IL-9 mRNA的表达显著高于结肠癌组织，差异具有统计学意义（P < 0.001，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 结肠癌组织及癌旁正常组织中IL-9 mRNA的表达 Figure 2 Relative mRNA expression levels of IL-9 in colon cancer tissues and adjacent normal tissues. ***P < 0.001.

结肠癌组织中IL-9的表达与肿瘤TNM分期、Ducks分期和淋巴结转移有相关性，且呈负相关：结肠癌Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ~Ⅳ期IL-9的阳性表达率分别为50.0%、25.0%；结肠癌A~B期、C~D期IL-9的阳性表达率分别为47.1%、24.4%，结肠癌TNM分期、Ducks分期越晚，IL-9的阳性表达率越低，差异均具有统计学意义（P < 0.05）；有淋巴结转移组IL-9的阳性表达率（22.2%）明显低于无淋巴结转移组（51.1%），差异具有统计学意义（P < 0.05）。结肠癌组织中IL-9的表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及肝转移等临床病理特征无明显相关性（P > 0.05，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 IL-9的表达与结肠癌临床病理特征的关系 Table 2 Associations between IL-9 expression and clinicopathological parameters of colon cancer patients Clinicopathological parameters n IL-9expression (n, %) χ2 P Negative Positive Gender 1.279 0.258   Male 53 36 (67.9) 17(32.1)   Female 39 22 (56.4) 17(43.6) Age(year) 1.596 0.206   ≤65 29 21 (72.4) 8 (27.6)    > 65 63 37 (58.7) 26(41.3) Tumor size (cm) 2.287 0.130   ≤3 17 8 (47.1) 9 (52.9)    > 3 75 50 (66.7) 25 (33.3) Differentiation 3.048 0.081   Poor or moderate 69 47 (68.1) 22(31.9)   Well 23 11 (47.8) 12(52.2) TNM staging 6.158 0.013   Ⅰ-Ⅱ 44 22 (50.0) 22 (50.0)   Ⅲ-Ⅳ 48 36 (75.0) 12(25.0) Ducks staging 5.013 0.025   A-B 51 27 (52.9) 24 (47.1)   C-D 41 31 (75.6) 10(24.4) Lymph node metastasis 8.208 0.004   Without 47 23 (48.9) 24(51.1)   With 45 35 (77.8) 10(22.2) Hepatic metastasis 3.763 0.052   With 6 6 (100.0) 0 (0.00)   Without 86 52 (60.5) 34 (39.5)

表 2 IL-9的表达与结肠癌临床病理特征的关系 Table 2 Associations between IL-9 expression and clinicopathological parameters of colon cancer patients

随访时间为6~72月，中位数为68月，随访率93.3%。92例结肠癌患者的5年总体生存率为57.6%（53/92）。IL-9表达阴性的结肠癌患者（58例）的1、3、5年生存率分别为94.8%、74.1%、53.4%；IL-9表达阳性的结肠癌患者（34例）的1、3、5年生存率分别为100.0%、91.2%、76.5%。单因素生存分析显示，与IL-9表达阴性的结肠癌患者相比，IL-9表达阳性患者的术后生存时间更长，且差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2）。

白细胞介素在抗肿瘤免疫应答中的作用日益受到关注^[12-13]。IL-9主要来源于活化的Th9细胞，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及肥大细胞等也可分泌产生，而肿瘤实质细胞不能表达IL-9；IL-9受体由2条链构成，分别为α链（IL-9Rα）和γ链（IL-9Rγ）；IL-9与其受体结合后，可激发JAK1、JAK3交叉磷酸化，从而激活STAT1、STAT3、STAT5形成同源及异源二聚体，进入细胞核内启动相关基因转录表达，发挥相应的生物学作用^[14-17]。IL-9的效应细胞为肥大细胞、T细胞亚群、抗原提呈细胞及树突状细胞等^[18]，这就决定了IL-9作用的多样性。IL-9具有促进炎症反应及自身免疫性疾病，抗寄生虫及抗结核等作用^[19-20]，近年的研究发现IL-9具有抗肿瘤免疫作用^[21]。

本研究发现，在结肠癌组织中IL-9蛋白及mRNA的表达均明显高于癌旁正常组织。近来关于IL-9的抗肿瘤作用日益受到关注。IL-9可抑制小鼠皮下黑色素瘤的生长速度及获得较长生存时间^[22]；Lu等^{[10, 23]}建立小鼠肺黑色素瘤模型发现IL-9可抑制小鼠肺转移灶数量；通过IL-9激发树突状细胞（DC）的功能来提高肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的抗肿瘤免疫^[24]；IL-9可抑制小鼠鳞状上皮细胞癌^[9]；建立Th9抗原特异性疫苗发现IL-9可抑制肿瘤细胞的种植以及扩散^[25]。本研究探讨了IL-9在结肠癌和癌旁组织的表达以及IL-9在结肠癌组织的表达与患者临床病理特征的关系，研究结果与上述结论一致，说明IL-9在恶性肿瘤中可能发挥了抗肿瘤免疫作用。其原因可能为肠道是人体重要的免疫屏障，结肠组织中存在数量及种类较多的免疫细胞，这些细胞分泌了较多的细胞因子，而肿瘤组织微环境中以肿瘤细胞为主，且免疫效应细胞处于免疫抑制状态，浸润的免疫细胞较少，因此分泌细胞因子IL-9较少。

本研究还发现IL-9在结肠癌组织中的表达与TNM分期密切相关，分期越晚IL-9的阳性表达率越低，这与Huang等^[11]研究发现Ⅲ~Ⅳ期结肠癌组织中IL-9的表达低于Ⅰ~Ⅱ期的结果一致，但该研究尚未对IL-9与其他临床病理特征及预后的关系作进一步研究。通过研究我们发现IL-9在结肠癌组织中的表达与Ducks分期、淋巴结转移呈负相关：Ducks分期越晚IL-9的阳性表达率越低，有淋巴结转移组的IL-9的阳性表达率明显低于无淋巴结转移组；IL-9的表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及肝转移等临床病理特征无明显相关性，提示结肠癌肿瘤微环境中高表达IL-9可能在抑制结肠癌的进展中发挥了重要作用。除此之外，通过生存分析我们还发现IL-9表达阳性的结肠癌患者的术后生存时间明显比IL-9表达阴性的患者长，提示IL-9的表达水平可评估结肠癌患者的预后情况。以上结果提示：IL-9可能具有较强的抗肿瘤作用；对结肠癌细胞有较强免疫反应的个体，可能通过在肿瘤微环境中聚集相应的抗肿瘤免疫细胞，分泌IL-9产生抗肿瘤免疫作用，抑制肿瘤细胞的局部侵犯和远处转移，所以预后较好。

关于IL-9激发抗肿瘤免疫反应的机制，已有一些研究进行了探索。在小鼠黑色素瘤中IL-9通过上调抗增值分子p21和凋亡分子TRAIL促进黑色素瘤细胞的凋亡^[26]；IL-9作用于效应细胞肥大细胞，激发固有免疫反应，发挥抗肿瘤作用^{[22, 25, 27]}；IL-9通过诱导肺癌组织CCL20-CCR6依赖的DCs细胞进入引流淋巴结，激活CTL细胞后引入肿瘤组织发挥抗肿瘤作用，同时刺激CD8+细胞介导的抗肿瘤免疫^{[10, 23]}；在小鼠鳞癌中金黄色葡萄球菌肠毒素B增加CD4+细胞信号转导及IL-9转录因子STAT5、HDAC1、PU.1的表达，促进IL-9产生，从而抑制鳞癌细胞生长^[9]。SIRT1对诱导IL-9分泌具有重要作用，其上游抑制信号为TAK1，SIRT1缺陷可活化和诱导下游信号mTOR-HIF1 α，促进IL-9的分泌从而抑制肿瘤进展^{[8, 28]}；GITR可通过转录因子STAT6和组蛋白乙酰化酶P300促进IL-9分泌^[29]；通过DCs表达的OX40及NF-κB信号通路可调节IL-9的产生^[30]。但目前对于IL-9的抗肿瘤作用机制尚未完全阐明。

综上所述，IL-9可能具有抗肿瘤免疫作用，与结肠癌的进展密切相关。因本研究为单中心研究，有待于大样本多中心研究证实；同时，IL-9在结肠癌微环境中的抗肿瘤免疫机制尚需细胞免疫学、分子生物学实验及动物实验进一步探讨，从而为结肠癌的临床免疫治疗提供新的理论基础。