近年来研究表明，不同浓度的活性氧自由基（ROS）参与心肌的生理过程及病理损害^[1]。需氧生物在氧化应激及酶联反应过程中产生ROS，生理状态下，适量ROS参与对正常细胞功能调节；但当ROS生成增加或内源性抗氧化酶功能失调时，ROS及其代谢产物在机体内异常聚集导致一系列损伤状态，即氧化应激^[2]。氧化应激是导致心血管系统结构、功能异常的重要原因之一，多种心血管疾病伴有氧自由基的生成增加，且疾病的严重程度与氧化应激水平呈正相关。因此，减轻氧化应激对心肌损伤具有重要的保护意义。

线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）是体内重要的醛类氧化酶，参与乙醇代谢，将乙醇代谢产物乙醛代谢成无害的乙酸，消除过氧化物和反应性醛，减轻乙醇及其代谢产物对细胞的氧化损伤^[3]。ALDH2对多种因素导致的心肌损伤均能发挥保护作用^[4-6]，但关于氧自由基与ALDH2在心肌损伤中的报道存在争议。特异性激动ALDH2可对抗心肌缺血再灌注损伤中氧化应激的发生^[7]，但Sun等^[8-9]报道ROS在小鼠心肌梗死及心衰期间并未参与ALDH2转染介导的心肌细胞保护作用。另有报道，ALDH2通过解毒4-HNE而不是减弱ROS产生来保护神经元细胞免受氧化应激^[10]。是否可以直接采用氧化应激干预观察ALDH2在心肌损伤中的变化，更明确地分析两者的关系？H₂O₂是一种重要的氧自由基，不仅能产生高活性的羟基基团，而且能够自由穿越细胞膜在细胞内弥散，研究中常使用外源性H₂O₂直接诱导细胞氧化损伤。ALDH2基因过表达增加了H₂O₂干预胃粘膜细胞的活力，ALDH2基因敲低具有相反的作用^[11]。H₂O₂加重心肌细胞凋亡^[12]，但H₂O₂与心肌细胞ALDH2的直接关联尚未见报道。因此，本研究为进一步明确氧化应激损伤与心肌细胞ALDH2之间的直接关联，采用一定浓度的H₂O₂直接干预H9C2心肌细胞，分析氧化应激和ALDH2的关系，为抗氧化损伤药物治疗心肌损伤提供理论研究基础。

细胞裂解液（增强型）、BCA蛋白定量试剂（碧云天）、0.25%胰酶消化液（含0.05% EDTA、GBICO），DMEM高糖培养基、胎牛血清（Hyclone），四甲基噻唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、Daidzin、Alda- 1（Sigma），小鼠抗大鼠GAPDH抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体（武汉博士德生物），兔抗大鼠ALDH2抗体（Abcam），ALDH2活性试剂盒（Abcam），大鼠H9C2心肌细胞系（上海吉凯），30%过氧化氢溶液（国药集团）。

H9C2心肌细胞接种于T-25无菌透气培养瓶中，37 ℃、5% CO₂条件下含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基培养。取细胞铺满培养瓶，80%~90%对数生长期细胞用于实验。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基将H₂O₂稀释成200、400、600、800 μmol/L的工作液，分别作用于心肌细胞1、2 h，MTT比色法检测各组细胞活力。结果显示200 μmol/L H₂O₂干预1 h，细胞存活率接近正常组50%（表 1），故本研究中选用200 μmol/L H₂O₂干预心肌细胞1 h诱导其损伤。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度H2O2干预1 h和2 h心肌细胞活力变化 Table 1 Changes of myocardial cell viability at 1 h and 2 h after exposure to different concentrations of H2O2 (Mean±SD, n=9) H2O2 (μmol/L) Treatment time (h) 1 2 0 0.377±0.015 0.377±0.015 200 0.151±0.010** 0.077±0.010** 400 0.125±0.010** 0.067±0.003** 600 0.126±0.014** 0.068±0.003** 800 0.122±0.013** 0.068±0.002** **P < 0.01 vs H2O2 (0 μmol/L).

表 1 不同浓度H2O2干预1 h和2 h心肌细胞活力变化 Table 1 Changes of myocardial cell viability at 1 h and 2 h after exposure to different concentrations of H2O2 (Mean±SD, n=9)

实验干预前给予细胞无血清DMEM培养基同步化18 h处理（每组细胞数相同）。将实验设置为5组：正常对照组（NG）：DMEM完全培养基；NG+ ALDH2激动剂Alda-1组（NG+Alda-1）：DMEM完全培养基，加入Alda-1使得其终浓度为20 μmol/L^[13]；H₂O₂损伤组（H₂O₂）：DMEM完全培养基稀释的200 μmol/L H₂O₂，干预1 h；H₂O₂+ALDH2激动剂Alda-1组（H₂O₂+ Alda-1）：DMEM完全培养基稀释的200 μmol/L H₂O₂，加入Alda-1使得其终浓度20 μmol/L，干预1 h；H₂O₂+ ALDH2抑制剂Daidzin组（H₂O₂+Daidzin）：DMEM完全培养基稀释的200 μmol/L H₂O₂，加入Daidzin使得其终浓度为60 μmol/L^[14]，干预1 h。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以被外源性的甲基四唑蓝（MTT）还原为蓝紫色结晶物沉积在细胞中，通过酶标仪检测A_{490 nm}处吸光度，间接反映活细胞数量。将H9C2心肌细胞悬液接种于96孔板，10⁴/孔，37 ℃、5% CO₂培养箱中常规培养24 h后，无血清处理18 h。实验条件干预后，每孔加入5 μg/mL的MTT试剂20 μL，37 ℃培养箱孵育4 h后，弃上清，加入150 μL二甲基亚砜，室温下摇床10 min后，酶标仪测定细胞A_{490 nm}。

H9C2心肌细胞以3×10⁵/mL接种于6孔板，实验干预条件处理之后每孔加入10 μmol/L的DHE溶液100 μL，37 ℃避光孵育30 min，D-Hanks液洗3遍，3 min/遍，4%的多聚甲醛固定10 min，荧光显微镜下观察，拍照。应用Image J软件进行荧光强度分析。

ALDH2具有脱氢酶活性，可以吸收氢质子而使其转化为相应的酸，即乙醛+ NAD⁺→酸+ NADH，按照ALDH2活性测定试剂盒说明书，测定A_{490 nm}吸光度检测各组心肌细胞ALDH2活性。选取3个不同批次心肌细胞，不同干预后提取各组细胞总蛋白。按照BCA试剂盒说明书测量蛋白浓度并计算出30 μg蛋白上样体积。取30 μg样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（10%分离胶+ 5%浓缩胶），电泳结束转移至0.45 μm的PVDF膜上，室温下封闭2 h，4 ℃孵育ALDH2一抗（1:3000）过夜，TBST洗膜后孵育二抗1 h，洗膜后ECL显影液显影。用Image J软件分析各条带的灰度值，以GAPDH为内参对照，计算各蛋白条带的表达水平。

采用SPSS 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，并用Newman-Keuls检验进行组间比较。P < 0.05认为差异有统计学意义。

MTT结果显示：与NG组相比较，不同剂量H₂O₂作用于心肌细胞1 h和2 h后，A_{490 nm}值均明显下降。其中200 μmol/L的H₂O₂作用1 h时，细胞存活率接近正常组50%，选取200 μmol/LH₂O₂干预1 h作为氧化损伤模型（表 1）。

200 μmol/L的H₂O₂处理H9C2心肌细胞1 h后，与NG组相比，细胞存活率明显降低（P < 0.05）；与H₂O₂损伤组相比，ALDH2特异性激动剂Alda-1明显升高细胞存活率（P < 0.05），ALDH2抑制剂Daidzin对H₂O₂引起的细胞存活率的降低无明显影响（P >0.05，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 不同组别心肌细胞损伤和细胞存活率的变化 Figure 1 Changes in cell survival rate in the cardiomyocytes after different treatments (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs NG; #P < 0.05 vs H2O2 group

与NG组相比，DHE荧光染色显示，H₂O₂损伤组红色荧光强度明显增强（P < 0.01）；与H₂O₂组相比，H₂O₂+ Alda-1组中细胞红色荧光强度明显减弱（P < 0.01），ROS水平降低；H₂O₂+Daidzin组中无明显影响（P >0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 不同组别心肌细胞氧化应激水平的变化 Figure 2 Changes of oxidative stress in different groups. A: DHE staining of H9C2 cells in different groups (× 100); B: ROS level in H9C2 cells with different treatments (Mean±SD, n=5). **P < 0.01 vs NG; ##P < 0.01 vs H2O2

与NG组相比，H₂O₂损伤组心肌细胞ALDH2活性和蛋白表达降低（P < 0.01）；与H₂O₂组相比，ALDH2激动剂Alda-1干预后ALDH2活性和蛋白表达明显升高（P < 0.01）；ALDH抑制剂Daidzin干预后，与H₂O₂组相比，ALDH2活性和蛋白表达无明显变化（P >0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 不同组别心肌细胞ALDH2活性和蛋白表达 Figure 3 ALDH2 activity and protein expression in different groups (Mean±SD, n=3). A: ALDH2 activity in different groups; B: ALDH2 protein levels in H9C2 cells normalized by GAPDH levels; C: Western blotting of ALDH2 and GAPDH in H9C2 cells; **P < 0.01 vs NG; ##P < 0.01 vs H2O2

心肌缺血及再灌注损伤过程伴随氧自由基（ROS）的大量产生和堆积，引发机体内源性氧化应激反应，加重心肌缺血损伤^[15]。氧自由基是细胞氧化应激的重要产物之一，其水平的高低反应了细胞受自由基攻击受损的程度^[16]。细胞内过多的ROS积累可导致DNA损伤，线粒体功能障碍，进一步加重ROS产生和细胞损伤，促进心肌重塑的发生和发展^[17]。

H₂O₂诱导H9C2细胞氧化应激的发生^[18]，H₂O₂可以显著增加细胞的氧化应激水平，降低超氧化物歧化酶在H9C2细胞中的活性^[19]。本研究为了直接观察氧自由基对心肌细胞的影响，采用H₂O₂直接诱导心肌细胞氧化应激损伤。有研究表明H₂O₂浓度（>300 μmol/L）过高，往往会导致细胞不可逆性损伤甚至死亡，低浓度H₂O₂则能通过激活细胞内各种信号转导机制，引起细胞损伤^[20-21]。我们的研究观察到，应用不同浓度H₂O₂干预心肌细胞1 h均可降低细胞的存活率，结合本实验MTT结果和Bihamta等^[19]的报道，我们选用200 μmol/L H₂O₂干预心肌细胞1 h作为损伤刺激。

糖尿病大鼠心肌损伤时ALDH2表达的高低与心肌功能损伤程度密切相关^[22]。ALDH2特异性激动剂Alda-1可通过直接激活和抑制失活两种方式增加ALDH2的活性^[11]。ALDH2保护作用的研究已经涵盖了全身多个重要组织器官。脑缺血再灌注损伤中，Alad-1可通过提高ALDH2活性发挥神经保护作用^[23]，Alda-1可通过降低毒性代谢产物有效改善心功能衰竭大鼠的心脏功能^[24]。人脐静脉内皮细胞转入ALDH2基因后，可明显减少ROS的增加，细胞抗氧化损伤作用显著增强^[25]。在环磷酰胺引起的急性肝毒性损伤中，ALDH2通过减少毒性醛的积累和ROS的产生减轻环磷酰胺引起的急性肝损伤^[26]。这些结果均提示，ALDH2可能是组织或器官拮抗氧化应激损伤的重要保护因子。

本研究观察到，H₂O₂直接干预心肌细胞后引起氧化应激损伤，表现为细胞内ROS释放水平增高，细胞存活率降低；给予Alda-1后显著增强ALDH2活性，ALDH2蛋白表达增加，ROS水平降低，氧化应激程度减轻，细胞存活率明显升高。提示Alda-1可以通过提高ALDH2的活性及表达直接对抗细胞的氧化应激损伤，对H₂O₂干预后的心肌损伤起保护作用。

值得注意的是，正常H9C2心肌细胞给予ALDH2激动剂Alda-1干预后，并未引起ALDH2活性及表达增加。我们推测，正常细胞内ALDH2表达呈相对稳定水平，Alda-1激动并不增高ALDH2的表达，但氧化应激损伤刺激导致体内ALDH2的活性和表达降低，Alda-1可激动体内ALDH2在一定范围内表达增高从而发挥心肌保护作用。

Daidzin作为ALDH2特异性抑制剂抑制ALDH2活性。有研究报道，大鼠心肌细胞缺氧损伤时，当ALDH2被Daidzin抑制后，心肌细胞对缺氧的耐受性明显下降，可能与ALDH2活性降低后引起ROS的产生增加及MAPK通路的激活有关^[27]。同时Daidzin使ALDH2失活后提高了酒精性心肌病中醛和p38MAPK磷酸化水平，加重乙醇诱导的心脏损伤^[28]。本课题组既往研究发现，提高ALDH2表达可抑制高糖引起的心肌成纤维细胞的增殖，改善氧化应激，而激动ALDH2同时给予其抑制剂Daidzin对抗ALDH2的表达后，其保护作用消失^[29]，提示体内一定含量的ALDH2是维持心肌细胞正常功能的重要保障之一。本研究结果显示，H₂O₂诱导心肌细胞损伤的基础上加入Daidzin干预，与H₂O₂组相比，并未引起细胞活力下降和氧化损伤的进一步加重，ALDH2活性和蛋白表达未出现明显下降，推测外源性H₂O₂干预引起的氧化应激损伤造成细胞损伤的重要机制之一，发挥了与Daidzin相似的作用，已直接降低了ALDH2的活性及表达。

综上所述，一定浓度的H₂O₂引起H9C2心肌细胞ALDH2活性及表达降低，激活ALDH2通过抑制氧化应激减弱H₂O₂诱导的心肌细胞损伤，其相关机制还有待进一步探讨。