2018, Vol. 38
2. 南京制药厂有限公司新药研发中心，江苏 南京 210007;
3. 广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤放射中心，广东 广州 510095;
4. 邵阳市中心医院药剂科，湖南 邵阳 422000
2. R&D Center, Nanjing Pharmaceutical Factory Co., Ltd., Nanjing 210007, China;
3. Department of Radiation Oncology, Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510282, China;
4. Department of Pharmacy, Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, China
目前，FDA批准上市的针对PD-L1的单克隆抗体有Atezolizumab [1]、Avelumab [2]及Durvalumab [3]。PD-L1抗体药物具有较好的疗效，副作用相对化疗药物较小[4]。但仍存在着免疫毒副作用，且容易因靶蛋白突变而产生耐药性[5-6]。因此，需要在更高水平如mRNA或DNA水平以靶向抑制PD-L1，降低毒副作用及耐药机率，增强抗肿瘤效应。
RNA干扰（RNAi）技术是基因功能的研究和疾病的基因治疗的重要工具[7-8]。目前关于针对PD-L1靶点的siRNA药物研究较少[9]，如将针对PD-L1基因的siRNA制备成具有肿瘤靶向性三元复合物[10]，纳米粒[11-12]，胶束[13]等，可特异性的沉默肿瘤细胞中PD-L1基因表达，激活T淋巴的杀伤作用，抑制肿瘤细胞增殖。与抗体药物相比，siRNA药物可从mRNA水平特异性沉默PD-L1蛋白的表达，除了具有抗体药物药效外，还可避免因PD-L1蛋白突变而失效的发生，此外构建肿瘤靶向载体给药，可有效降低其他器官的免疫毒副作用[14-15]。因此，在mRNA水平抑制PD-L1蛋白的siRNA药物，可单独或联合现有抗体药物使用，具有极大的治疗肿瘤的潜力。
siRNA序列具有碱基序列特异性及双链退火温度（Tm）差异性，针对相同靶基因设计的不同siRNA序列，其沉默效率、脱靶效应及免疫原性等存在差异[16-17]。因此，设计并得到高效的siRNA序列是开发RNAi药物的基础。本研究首先通过计算机辅助设计了多条靶向PD-L1 mRNA的候选siRNA序列，然后通过RT-qPCR、流式细胞术及Western blot实验，在基因和蛋白水平筛选出能高效特异性沉默U87 MG细胞中PD-L1 mRNA表达的最佳序列。进一步应用流式细胞术及CCK-8实验验证了CD8+T细胞对经最佳siRNA序列转染后U87 MG细胞的凋亡及增殖的影响，为基于PD- L1 siRNA序列的肿瘤疗法的研究奠定了基础。
1 材料和方法 1.1 材料胎牛血清、DMEM培养基等均购自Gibco。siRNA及引物由广州锐博公司合成。Trizol试剂，转染试剂Lipofectamine 2000、opti-MEM等均购自Invitrogen。逆转录试剂盒，实时定量荧光（Real-time）PCR相关试剂购自日本TakaRa。PD-L1 Monoclonal Antibody（MIH5）-PE购自Ebioscience。Anti-human PD-L1（17952-1-AP）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗，购自Proteintech。PVDF膜购自Millipore。CCK 8试剂盒购自日本同仁化学公司。细胞凋亡检测试剂盒购自广州杰特伟生物科技有限公司。CD8+T细胞分离试剂盒购自德国美天旎公司。
1.2 仪器ABI 7500实时定量PCR仪：美国Life；超净工作台（JW-CJ-1F）：苏州净化设备厂；IX71型倒置显微镜：日本Olympus；Galaxy S型CO2培养箱：英国Galaxy R；5810 R型高速离心机：德国Eppendorf；FACSCalibur流式细胞仪：美国BD；Mini电泳槽：Amershem。
1.3 方法 1.3.1 设计沉默PD-L1基因的siRNA序列根据Tuschl等[18]提出的siRNA设计规则在所选基因的启动子100个碱基以后开始设计；正义链的GC含量应为30%~ 50%；正义链的第1个碱基必须为G或C；正义链的第10个碱基是U；正义链的第13个碱基不能是G；正义链的第19个碱基不能是G或C应尽量避免出现稳定的发夹型二级结构，并运用BLAST在Genbank中进行同源性分析。根据siRNA的设计原则，采用siDirect软件设计，获得针对PD-L1基因（序列号NM_001141351.1）表达的不同核苷酸序列的siRNA。运用BLAST进行同源性分析，在Genbank中进行BLAST，确定序列无误并且与其它基因不存在同源性，最终确定序列，由广州市锐博生物科技公司合成。
1.3.2 人神经胶质瘤细胞系培养人神经胶质瘤细胞系（U87 MG），购置于ATCC。U87 MG细胞贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO2，2 d换液1次，4 d传代1次。
1.3.3 实验分组实验组：加入含siPD-L1-1~10与Lipofectamine 2000转染混合物，siRNA终浓度为100 nmol/L。阳性对照组：以专利（专利号US20170067060）中的沉默PD-L1基因的siRNA序列（siPD-L1-PC）为阳性对照。加入含siPD-L1-PC与Lipofectamine 2000转染混合物，siRNA终浓度为100 nmol/L。阴性对照组：加入与人转录组无同源性的siRNA序列（siNC），siRNA终浓度100 nmol/L。空白对照组（Control）：只加入Lipofectamine 2000转染试剂。每组设3个复孔。
1.3.4 对U87 MG细胞进行siPD-L1的转染取对数生长期的细胞，接种于12孔板中，5×104/孔。待细胞贴壁后，移去完全培养基，用PBS洗2遍，每孔加入400 μL Opti-MEM。按照实验分组，每组分别将3 μL的lipofectamine 2000加入150 μL的Opti-MEM中，将7.5 μL siRNA加入150 μL的Opti-MEM中，室温下放置5 min后，混合，室温孵育15 min，配置成转染液。每组3个复孔，每孔加100 μL转染液，置于37 ℃，5% CO2孵箱中培养。培养12 h后换液，继续培养36 h后检测转染效率。
1.3.5 RT-qPCR法检测U87 MG细胞PD-L1 mRNA表达水平收集转染后的细胞样本，参照Trizol试剂盒说明书，每个样品孔中加入1 mL细胞裂解液（Trizol），充分裂解后，将细胞裂解液吸至无菌去酶的EP管中。每支EP管中加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，静置10 min。4 ℃，12 000 g/min离心15 min。吸取上层的水相，转至另一EP管中。加入200 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀，于静置放置10 min。4 ℃，2000 g/min离心15 min，可见RNA白色沉淀。弃上清，加入l mL 75%乙醇，清洗沉淀后，每支EP管中加入适当DEPC水溶解沉淀，测定RNA的浓度和纯度。
按照反转录配置反应液：5 × PrimeScript@ RT Master Mix for Real Time*1 2 μL，RNase Free dH2O 6 μL，样品2 μL。按以下条件反转录成cDNA，37 ℃ 15 min→85 ℃ 5 s→4 ℃。
用Primer primier 5软件设计PD-L1引物进行RTPCR检测。
PD-L1引物序列：正向5'-TGTACCGCTGCATGATCAG-3'；
反向5'-AGTTCATGTTCAGAGGTGACTG-3';
GAPDH引物序列：正向5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'；
反向5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。
按下列组成配置PCR反应液：SYBR premix Ex Tap Ⅱ（2×）（10 μL），ROX Reference Dye（50×）（0.4 μL），Primer F/R（0.8 μL, 10 μmol/L），sample cDNA（2 μL），RNase Free dH2O（6 μL）。混匀后按以下条件进行PCR反应：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。40个循环，然后进行数据分析：各目的基因表达水平的变异用变化倍率2-△△Ct以计算来表示。
1.3.6 Western bolt法检测U87 MG细胞PD-L1蛋白表达水平把siPD- L1-NC、siPD-L1-PC、siPD- L1-3、siPD-L1-5和siPD-L1-8分别转染细胞后，提取转染各组细胞的总蛋白：转染72 h后弃去培养基，用预冷的PBS洗细胞2~3次。加入RIPA蛋白提取试剂（每个皿中加入RIPA裂解液200 μL和PMSF 20 μL），于冰上裂解30 min（不断晃动使裂解充分）。用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶一侧，然后将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中，整个操作在冰上进行。于4 ℃，12 000×g离心15 min，将离心后的上清液转移至0.5 mL的干净无菌离心管中，BCA法测蛋白含量。各样品组上样量相同，进行Western blotting检测：SDS-PAGE电泳分离蛋白，将凝胶上的蛋白用湿法转移到PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜上不含目的蛋白的结合位点，然后用anti-human PD-L1（17952-1-AP, proteintech）的抗体（一抗）处理，接着再用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗与一抗结合。用ECL显影。
1.3.7 流式细胞术检测U87 MG细胞表面PD-L1的蛋白表达水平U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC，siPD-L1-PC、siPD-L1-1~10后，将上述各组实验样本用PBS洗涤2次，消化（1000 r/min离心5 min）收集细胞，加入100 μL PBS悬浮细胞后，加入5 μL PD-L1抗体混匀后，于4 ℃在避光条件下反应30 min。反应完全后，离心，去除抗体，用PBS洗2遍后，用200 μL PBS重悬细胞，上机检测。
1.3.8 人CD8+T细胞的提取分离（CD8磁珠阳性选择富集CD8+T细胞）80 μL PBMCs+20 μL CD8磁珠，混匀，4 ℃冰箱孵育15 min；加1~2 mL PBS（含1% FCS），1800 r/min，离心5 min，PBS（含1% FCS）重悬细胞，调整细胞密度为1×108/mL（备用）；将分选柱置于磁铁上，预先用3 mL PBS（含1% FCS）冲洗分选柱（LS），保持分选柱湿润，将上述细胞悬液过柱，细胞悬液不中断，过柱后3 mL PBS（含1% FCS）洗3遍；取下分选柱，分选柱内加5 mL PBS（含1% FCS），用推头推出分选柱内液体并收集，所收集液体即为CD8+T细胞悬液。
1.3.9 流式细胞术检测CD8+T细胞对转染siPD-L1后的U87 MG细胞凋亡的影响U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC，siPD-L1-PC，siPD-L1-1~ 10等48 h后，每孔加入约4×104人CD8+T细胞共同孵育。24 h后，消化各组细胞，PBS清洗两遍，加入5 μL Annexin V-FITC，5 μLPI后，4 ℃，孵育15 min，上机检测。
1.3.10 CCK-8检测CD8+T细胞对转染siPD-L1后的U87 MG细胞增殖的影响U87 MG细胞分别经lipofectamine 2000转染siNC，siPD-L1-PC，siPD-L1-1~ 10等48 h后，每孔加入约4×104 CD8+T细胞共同孵育。24 h后，PBS清洗2遍，洗去T细胞，加入CCK-8试剂孵育1 h后，在450 nm波长进行上机检测。
1.4 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件分析，数据均以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 核苷酸序列采用siRNA设计法则并结合计算机辅助设计软件所设计候选的siRNA靶序列、正义链和反义链中含有的核苷酸序列（表 1）。
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表 1 候选的siRNA靶序列、正义链和反义链中含有的核苷酸序列 Table 1 Nucleotide sequences contained in candidate siRNAtarget sequences, sense and antisense strands |
RT-qPCR验证siPD-L1-1~10在U87 MG细胞中沉默PD-L1 mRNA效率，实验结果如图 1所示，在mRNA水平，与Control组比，siPD-L1-1、siPD-L1-2 siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1基因mRNA的表达（P < 0.05），其效果与siPD-L1-PC作用类似。
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图 1 RT-qPCR检测U87 MG细胞中PD-L1的mRNA表达 Figure 1 Expression of PD-L1 mRNA levels in transfected U87 MG cells detected by RT-qPCR. *P < 0.05 vs control. |
Western blot验证siPD-L1-NC、siPD-L1-PC、siPDL1-3、siPD-L1-5和siPD-L1-8在U87 MG细胞中沉默PD-L1效率，实验结果如图 2所示，在蛋白水平，与Control组比，siPD-L1-3、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1基因蛋白的表达（P < 0.05），其效果与siPD-L1-PC作用类似。
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图 2 U87 MG细胞中PD-L1的蛋白表达量 Figure 2 Expression of PD- L1 protein in transfected U87 MG cells. A: Western blotting for PD-L1 expression; B: Quantitative analysis of PD-L1 protein levels. *P < 0.05 vs control. |
流式细胞术验证siPD-L1-1~10在U87 MG细胞中沉默PD-L1蛋白效率，结果如图 3所示，在蛋白水平，与Control组比，siPD-L1-1、siPD-L1-2 siPD-L1-3、siPDL1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著沉默PD-L1蛋白的表达（P < 0.05），其效果与siPD-L1-PC作用类似。以siPD-L1-3、siPD-L1-5及siPD-L1-8效果较佳，并对这3条序列进行后续的细胞功能研究。其中siPD-L1-3沉默效率最高，剩余PD-L1蛋白表达量为44.8%。
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图 3 U87 MG细胞表面PD-L1蛋白表达量 Figure 3 PD-L1 protein expression on U87 MG cell surface detected by flow cytometry (A) and quantitative analysis (B). *P < 0.05 vs control. |
流式细胞术验证，转染相应的siPD-L1序列沉默PD-L1后，研究人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用。实验结果如图 4显示，与对照组相比，siPD-L1-3和siPD-L1-8均明显增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用（P < 0.05），其中siPD-L1-3的作用最为显著，凋亡率为33%。
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图 4 U87 MG细胞凋亡率 Figure 4 Apoptotic rate of transfected U87 MG cells incubated with human CD8+T lymphocytes. A: Results of flow cytometry; B: Quantitative analysis of the results. *P < 0.05 vs control. |
CCK-8实验检测转染相应的siPD-L1序列沉默PD-L1后，研究人CD8+T细胞对U87MG细胞增殖抑制作用。实验结果如图 5显示，与对照组相比，siPD-L1-3和siPD-L1-8均明显增强CD8+T细胞对肿瘤细胞增殖的抑制（P < 0.05），其中siPD-L1-3的作用最为显著，抑制率可达60%。
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图 5 CCK-8检测U87 MG细胞增殖情况 Figure 5 Proliferation of transfected U87 MG cells incubated with human CD8+T lymphocytes detected by CCK-8 assay. *P < 0.05 vs control. |
研究发现，在神经胶质瘤患者体内，PD-L1的高表达能够增强肿瘤的转移及免疫逃逸能力，导致患者死亡率上升[19-20]。因此，设计小分子抑制剂、抗体或者siRNA抑制PD-1或PD-L1通路，从而利用机体T细胞直接杀灭肿瘤细胞，已成为肿瘤免疫疗法的热点[21-22]。
RNA干扰效应分子有micro RNA和siRNA等[23]。而siRNA因其效率高，且通过简单的化学合成即可获得，因而具有治疗疾病的应用前景[24-25]。目前国内外关于PD-L1及siRNA均有了较深入的研究，但是将两者结合起来研究的则甚少[26-27]。本研究利用siDirect在线设计，并通过运用BLAST在Genbank中进行同源性分析排除了与非靶基因有大于或等于15个碱基匹配的序列，双链Tm小于21.5 ℃，从而得到了10条候选siRNA序列，通过化学合成的方法获得候选siRNA分子。但由于mRNA可能存在二级结构，或者存在一些蛋白或核糖体的粘附，使得并不是所有候选序列都具有RNA干扰作用[28]。因此，需要通过实验筛选而得到最佳的siRNA序列。本实验采用阳离子脂质体法（lipofectamine 2000），通过带正电的脂质体，与核酸带负电的磷酸骨架形成复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，通过膜的融合或细胞内吞作用导入细胞内[23]。此法因其简单方便，细胞毒性低，重复性高，可以在siRNA浓度较低的条件下转染。
本文筛选出6条高效特异性沉默PD-L1表达的siRNA序列。通过RT-qPCR、Western blot及流式细胞术实验得出，与对照组相比，siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均能显著沉默PD-L1的mRNA及蛋白表达，并且可显著增强CD8+T细胞的杀伤作用，其中siPD-L1-3序列沉默活性最佳，且该序列比专利（专利号US20170067060）提供的siRNA序列（siPD-L1-PC）活性要佳。以siPD-L1-3序列转染U87 MG细胞后，使得CD8+T细胞引起肿瘤细胞的凋亡率达33%，且肿瘤细胞生长的抑制率可达60%。这可能与siPD-L1-3的GC含量适中，Tm值符合要求，且能避开mRNA二级结构及核糖体粘附区域有关。因此，本研究进一步丰富了siRNA序列的设计规则，将为设计高效沉默基因的siRNA序列提供思路。此外，本研究设计siRNA分子能够有效降低肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达水平，可解除或减弱PD-L1对CD8+T细胞的抑制，从而促进T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制肿瘤生长。可利用该原理，构建合适的体内给药系统，把siPD-L1序列，递送至胶质瘤细胞内，从而获得新的胶质瘤治疗方法[29-30]。综上所述，本研究设计并筛选出了一条全新的可特异性高效沉默PD-L1 mRNA的siRNA序列，该序列未见国内外文献及专利报道过，其沉默PD-L1mRNA表达的效价高于专利报道的水平，为后续开发抗肿瘤药物奠定了基础。
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