2018, Vol. 38
乳腺癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一，往往成为致死的主要病因。在乳腺癌的治疗中，除了手术、放射和内分泌治疗以外，还有非常重要的化学药物辅助治疗[1]。阿霉素是治疗乳腺癌的经典药物，但是心脏毒性等不良反应均限制了它在临床的应用，因此寻找增强阿霉素抗肿瘤活性，并降低不良反应的方法迫在眉睫[2]。
缝隙连接（GJ）是细胞与细胞之间物质交换的重要通道，由连接蛋白（Cx）组成[3]。研究表明在肿瘤的产生和发展中，Cx的表达通常会下降或缺失，而通过增加细胞Cx的表达可以依赖或不依赖细胞GJ从而抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡[4]。也有研究表明，Cx可能会促进晚期肿瘤的外渗和转移[5]。在乳腺上皮细胞中以Cx43、Cx26等表达水平较高，本课题组前期研究也证明，在肿瘤细胞中，对GJ的调控可以影响化疗药物的抗肿瘤作用，且Cx43表达水平与肿瘤的恶性程度有一定的相关性[6]。然而，目前尚无文献报道在雌激素受体阳性（ER+）的乳腺癌细胞和雌激素受体阴性（ER-）的细胞中比较Cx43蛋白的表达和GJ功能，并通过对GJ功能的调控观察阿霉素对两种不同性质乳腺癌细胞毒性的影响。因此，本研究将首先比较ER（+）的MCF-7细胞和ER（-）的MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白的表达及GJ功能。然后分别采用药理学和分子生物学两种方法调控MCF-7细胞的GJ功能，观察对阿霉素抗乳腺癌作用的影响。本实验将从增强细胞GJ功能和抑制GJ功能两个角度分别探讨对阿霉素毒性的影响，并进一步通过沉默Cx43基因，观察对GJ功能及阿霉素抗肿瘤作用的影响。以期为ER（+）的乳腺癌细胞临床治疗提供新靶点，扩大阿霉素的临床应用。
1 材料和方法 1.1 材料细胞株MCF-7、MDA-MB-231细胞购自上海细胞库，由蚌埠医学院药理实验室冻存。阿霉素、维甲酸、油酸酰胺、18- alpha -甘草次酸、胰酶、MTT、二甲基亚砜均购于美国Sigma；DMEM高糖培养基、胎牛血清、荧光染料calcein-AM购于美国Gibco。阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、Opti-MEM培养基、ECL发光试剂盒购于Invitrogen；Cx43单克隆抗体为美国Sigma产品，羊抗鼠β-actin单克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均购自Bio-Rad。其他试剂均是国产分析纯级。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养ER（+）乳腺癌MCF-7细胞培养于MEM培养基，ER（-）乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于DMEM高糖培养基，分别含有10%（V/V）胎牛血清、0.01 mg/mL人胰岛素、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素，放置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养。传代时采用0.25%胰蛋白酶溶液，1周传代2~3次，传代比例约为1: 3。
1.2.2 MTT检测GJ功能的调控对阿霉素抗肿瘤作用的影响将细胞按5×104 /mL的密度接种于96孔板，每组设5个复孔。细胞经GJ功能药物预处理（RA：24 h，oleamide：1 h，18-α-GA：1 h）后，再用阿霉素刺激24 h，检测细胞存活率。另设阴性对照组（不加药物）和空白对照组（不加细胞，只加培养基）。终止培养前4 h，每孔加MTT 15 μL（5 g/L）37 ℃下孵育，检测前弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL /孔，37 ℃下孵育30 min，微量振荡器震摇8 min，酶标仪测定每孔在A490nm处的吸光度值，实验重复4次。
1.2.3 Western blotting检测细胞中Cx43总蛋白的表达收集MCF-7和MDA-MB-231细胞，冰上裂解30 min，提取总蛋白，BCA蛋白定量法测各组蛋白浓度，用细胞裂解液配平各组蛋白浓度，与2×上样缓冲液1:1混合，100 ℃下煮沸5 min使蛋白变性。经SDS-PAGE电泳（10%分离胶）分离后电转至PVDF膜上。脱脂牛奶室温下封闭2 h；Cx43一抗采用Western blotting一抗稀释液按1: 5000的比例稀释，4 ℃下孵育过夜；摇床上用TPBS洗10 min×3次；羊抗鼠lgG二抗用脱脂牛奶按1:4000稀释，室温下孵育2 h；TPBS洗10 min×3次；ECL试剂盒避光下显影曝光。Bio-Rad凝胶成像系统采集图像。以β-actin为内参对照。
1.2.4 细胞免疫荧光法观察细胞膜Cx43蛋白表达以5×104 /mL的密度将MCF-7和MDA-MB-231细胞接种于六孔板中盖玻片上，培养箱中培养2 d，吸去培养基，PBS洗5 min×2次；4%多聚甲醛-0.1% Triton溶液室温下固定细胞10 min，PBS洗10 min×2次；1% BSA封片2 h；Cx43一抗用一抗稀释液按1:500的比例稀释，4 ℃孵育过夜（勿摇晃），PBS洗10 min×3次；二抗用TPBS按1:200稀释，放置37 ℃下湿盒中孵育2 h，PBS洗10 min×3次；碳酸甘油缓冲液封片，倒置荧光显微镜观察、拍照。
1.2.5 细胞接种荧光示踪法测定MCF-7细胞间GJ功能将两株细胞以10×104 /mL的密度接种于十二孔板内，药物处理后，将荧光指示剂calcine-AM与其中一孔细胞共同孵育，calcine-AM可以通过GJ通道进入细胞浆内。该细胞称为“供体细胞”。然后将“供体细胞”接种到已生长融合（有条件形成GJ）的细胞中，培养4 h。待供体细胞贴壁，并与相邻细胞形成稳定的GJ后，小分子的calcine-AM（发绿色荧光）可以通过GJ进入相邻的细胞。实验结果采用倒置荧光显微镜观察，以一个“供体细胞”周围含有绿色荧光的细胞数量多少作为GJ功能指标[7]。
1.2.6 siRNA序列的设计与合成针对人源Cx43基因小分子干扰RNA片段由上海吉玛公司设计合成。Cx43siRNA和阴性对照siRNA序列分别为：Cx43siRNA：（正义链）：5'-GGAAGCACCAUCUCUA ACUTT-3'，（反义链）：5'-AGUUAGAGAUGGUGCUU CCTT-3'；Negative control：（正义链）：5'-GGCCUUG AAUAUCAUUGAATT-3'，（反义链）：5'-UUCAAUGA UAUUCAAGGCCTT-3'。SiRNA序列作BLAST比对，以保证和其他基因没有同源性，siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。
1.2.7 统计学分析实验结果使用SPSS 11.0软件进行分析。资料以均数±标准差表示，两组之间计量资料比较采用t检验，统计图表采用Sigma Plot 12.0绘制，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 MCF-7和MDA-MB-231细胞中Cx43蛋白的表达及细胞GJ功能Western blotting结果表明，MCF-7细胞中Cx43的总蛋白表达水平显著高于MDA-MB-231细胞（图 1A）；细胞免疫荧光结果显示，ER（+）的乳腺癌MCF-7细胞胞膜Cx43绿色荧光比ER（-）乳腺癌细胞MDA-MB-231更强，在MDA-MB-231细胞膜上只见到极少数的绿色荧光斑（图 1B）；MCF-7细胞的GJ功能显著高于MDAMB-231细胞（图 1C、D）。
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图 1 MCF-7和MDA-MB-231细胞Cx43蛋白表达水平及GJ功能 Figure 1 Expression of Cx43 and function of gap junction in MCF-7 and MDA-MB-231 cells. A: Total Cx43 protein detected by Western blotting; B: Expression of Cx43 on the cell membrane (Original magnification: × 400); C: Function of gap junction assessed by parachute dye-coupling assay (×400); D: Bar chart of the results of the parachute assay. **P < 0.01 vs MCF-7 cells. |
选用0~24.0 μmol/L的阿霉素作用于MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h后，MTT结果显示：随着药物浓度的提高，两珠细胞的存活率明显下降。24.0 μmol/L阿霉素作用于MCF-7细胞24、36、48 h后，细胞存活率分别为56.35%、51.36%、44.89%。阿霉素作用于MDAMB-231细胞24、48、72 h后，细胞存活率分别为69.25%、42.43%、97.96%（图 2）。
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图 2 阿霉素对MCF-7和MDA-MB-231细胞24、36、48 h存活率的影响 Figure 2 Surviving fraction of MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with adriamycin for 24, 36, and 48 h (MTT assay, n=4). A: Surviving fraction of MCF-7 cells treated with 0 to 24.0 μmol/L adriamycin. **P < 0.01 vs 0 μmol/L adriamycin group; B: Surviving fraction of MDA-MB-231 cells treated with 0 to 24.0 μmol/L adriamycin. **P < 0.01 vs 0 μmol/L adriamycin group. |
在MCF-7细胞中，用10.0 μmol/L的RA（此浓度RA对细胞无毒性）预处理24 h，细胞接种荧光示踪法结果显示，与对照组相比，RA预处理后的细胞荧光传递增强了112.86%（图 3A）。图 3B结果显示，高密度接种细胞时（细胞生长融合，有GJ形成），6.0 μmol/L的阿霉素作用于细胞24 h的细胞存活率为0.64±0.03，而10.0 μmol/L的RA预处理24 h，再用阿霉素刺激细胞24 h，MCF-7细胞存活率为0.43±0.04，低于阿霉素单用组，差异有统计学意义（P < 0.01）。而在低密度接种的细胞（细胞生长未融合，无GJ形成），用RA预处理组的细胞存活率（0.56±0.03）与阿霉素单用组（0.52±0.04）相比，差异无统计学意义（P>0.05）。
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图 3 维甲酸在MCF-7细胞中增强阿霉素的细胞毒性 Figure 3 Retinoic acid increased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean±SD). A: Fluorescence images (×400) showing dye coupling in parachute assay and quantitative analysis. **P < 0.01 vs control group; B: Retinoic acid increased the antitumor activity of cisplatin in A549/CDDP cells with high- or low-density GJ. **P < 0.01 vs ADM group. |
选用oleamide和18-α-GA两种GJ功能抑制剂预处理细胞，细胞接种荧光示踪法结果显示：25.0 μmol/L oleamide和10.0 μmol/L 18-α-GA分别预处理MCF-7细胞1 h，细胞荧光传递分别降低了70.24%和33.62%（图 4A）。接着采用高低密度接种法，观察25.0 μmol/L oleamide和10.0 μmol/L 18-α-GA预处理后对阿霉素细胞毒性的影响。在高密度接种细胞时（细胞生长融合，有GJ形成），6.0 μmol/L的阿霉素作用于细胞24 h的细胞存活率为0.69±0.03，而25.0 μmol/L的oleamide和10.0 μmol/L18-α-GA分别预处理细胞1 h，再用6.0 μmol/L的阿霉素刺激细胞24 h，MCF-7细胞存活率分别为0.86 ±0.04、0.83±0.07，均显著高于阿霉素单用组（P < 0.01，图 4B）。而在低密度接种的细胞（细胞生长未融合，无GJ形成），用oleamide和18-α-GA预处理组的细胞存活率分别为0.50±0.03、0.53±0.06与阿霉素单用组（0.54± 0.04）相比，差异无统计学意义（P>0.05）。
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图 4 油酸酰胺和18-α-甘草次酸在MCF-7细胞中降低阿霉素的细胞毒性 Figure 4 Oleamide and 18-α-GA decreased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean± SD). A: Fluorescence images of parachute dye-coupling assay (× 400). **P < 0.01 vs control group; B: Oleamide and 18-α-GA decreased the antitumor activity of cisplatin in A549/CDDP cells with high-or low-density GJ. **P < 0.01. |
Western blot结果显示，将Cx43siRNA转染入MCF-7细胞后，Cx43蛋白表达显著降低。细胞免疫荧光法结果显示，转染了siRNA后，MCF-7细胞膜的Cx43蛋白表达显著降低（图 5A、B）。在高密度接种的细胞（细胞生长融合，有GJ形成），单用阿霉素组细胞的存活率为68.85±0.03，siRNA沉默Cx43后，使MCF-7细胞GJ功能减弱，与单用阿霉素组相比，细胞存活率增加84.23±0.05（P < 0.01）。阴性对照组细胞存活率为98.02±0.02，与单用阿霉素组比较差异无统计学意义（P>0.05）。在低密度接种的细胞（生长未融合，无GJ形成），与单用阿霉素相比，Cx43siRNA对阿霉素的细胞存活率无明显影响（P>0.05，图 5C、D）。
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图 5 Cx43siRNA在MCF-7细胞中降低阿霉素的抗肿瘤作用 Figure 5 Cx43 siRNA decreased the cytotoxicity of adriamycin (ADM) in MCF-7 cells (n=4, Mean±SD). A: Expression level of Cx43 detected by Western blotting; B: Immunofluorescence assay of expression of Cx43 on the membrane; C: Fluorescence images of parachute dye-coupling assay (×400). **P < 0.01 vs control group; D: Cx43siRNA decreased the antitumor activity of adriamycin in A549/CDDP cells with high-or low-density GJ. **P < 0.01 vs the control group. ##P < 0.01 vs the ADM group. |
目前对细胞缝隙连接调控的方式主要有工具药物和基因沉默/过表达[8]，药物诱导主要是通过文献查阅的比较公认的工具药物，如RA [9]、维生素A、黄芩素[7]等，增强细胞GJ功能，从而加强细胞间的物质交流，课题组前期研究证明黄芩素可以通过增加细胞Cx43蛋白的表达从而增强睾丸间质细胞TM4的GJ功能；而目的基因转染也是常用的恢复和上调肿瘤细胞GJ功能的方法。黄酮类药物黄连素在肺腺癌A549细胞中可以通过增加Cx43蛋白的表达从而增强顺铂的抗肿瘤作用。这表明，化疗药物的抗肿瘤作用可以通过调控细胞GJ功能来实现。
乳腺癌的发病率在所有女性恶性肿瘤中占首位，阿霉素是乳腺癌治疗的经典药物，但心脏毒性等不良反应比较严重，且长期使用以后，乳腺癌对其敏感性下降均在很大程度上影响了乳腺癌的治疗[10]。因此，找到增强阿霉素抗肿瘤作用的方法对于临床乳腺癌的治疗至关重要。雌激素受体是影响乳腺癌患者主要的预后因素之一，目前对乳腺癌的分型常用指标为：ER和孕激素受体（PR）等。通常ER（+）的乳腺癌恶性程度较低，预后较好[11-12]。在ER（+）的原发性乳腺癌中，Cx43mRNA的表达可以与肿瘤的抑制相关，而对ER（-）的乳腺癌却起到相反的保护作用[13]。Cx43对肿瘤生长的潜在控制可能有助于ER（+）乳腺肿瘤更好地分化和患者生存质量的提高[14]。在ER（-）乳腺癌中，其他途径比Cx43的表达更占主导地位，如Wnt-1和/或Ras-Raf-MAPK活化，它们负责分化出较差的表型、导致更差的预后[15]。本研究结果显示，在细胞水平中，ER（+）的乳腺癌中Cx43表达水平显著高于ER（-）的乳腺癌。但在ER（+）的乳腺癌中，从调控GJ功能及Cx蛋白的角度来治疗乳腺癌的研究尚缺乏，因此，本实验开展了一系列的实验。
正常乳腺组织表达Cx26、Cx32和Cx43等连接蛋白，其中Cx43是乳腺组织中含量较丰富的蛋白，且被广泛研究[4, 6]。本实验结果表明，在ER（+）的MCF-7乳腺癌细胞中Cx43蛋白的表达水平高于ER（-）的MDAMB-231细胞，且由Cx43形成GJ的功能也显著增强，MDA-MB-231细胞中几乎不表达Cx43。这表明，Cx43在乳腺癌细胞中的表达可能与ER的表达水平相关。于是后续研究将集中在ER（+）的MCF-7细胞中，通过调控细胞GJ功能观察对阿霉素抗肿瘤作用的影响。
肿瘤细胞中的Cx往往会缺失，而恢复Cx的表达可以增加肿瘤细胞的死亡[4, 16]。在间皮瘤细胞中，Cx43表达增多可以增强顺铂的细胞毒性[17]，这表明，细胞中Cx43的表达对化疗药物敏感性密切相关。但是该过程是否与GJ的形成有关呢，我们不得而知，因此本实验采用了高低密度接种细胞的方法。GJ形成需要细胞与细胞之间相互接触，接触越紧密，形成的GJ越多，调控GJ后效果就越显著。
单独用药可以治疗鳞状细胞癌和黑色素瘤等肿瘤[18-19]。课题组前期研究表明，RA在不影响细胞增殖的情况下可以增强细胞GJ功能，从而影响化疗药物的细胞毒性[6]。本实验同样采用对MCF-7细胞无毒性的10.0 μmol/L的RA预处理24 h，结果表明RA可以增强细胞GJ功能，并增加阿霉素的抗乳腺癌作用。
Oleamide的作用机制仍不明确，可能是通过抑制Ca2+通过GJ进入细胞，从而抑制细胞的死亡[20]。研究表明其衍生物MI-22等可以通过下调细胞Cx26的表达，从而抑制GJIC，阻碍细胞的侵袭转移[21]。在转染了Cx32/Cx26的宫颈癌细胞Hela中，经多西环素的诱导后，加入GJ抑制剂18-α-GA，能显著降低顺铂和奥沙利铂的细胞敏感性[22]。但是对于oleamide和18-α-GA能否影响乳腺癌MCF-7细胞中由Cx43形成的GJ功能不得而知。本研究证明oleamide和18-α-GA可以显著抑制MCF-7细胞GJ功能，从而降低阿霉素对MCF-7的毒性。药物可以通过改变Cx的结构、数量及分布，或直接调控GJ功能调控细胞GJ功能[4, 23]。Oleamide和18-α-GA主要是通过改变细胞GJ的“门控”功能，即通透性而产生的。
为了排除药物可能通过其他途径影响细胞GJ功能[24]，本实验选择采用siRNA从基因水平特异性地沉默Cx43。结果表明，SiRNA干扰后的MCF-7细胞中Cx43总蛋白和细胞膜蛋白表达均显著降低，细胞间GJ功能和阿霉素的毒性也均显著降低。这进一步证实Cx43在乳腺癌的发生发展中，扮演着抑癌基因的角色[25]。微小RNA（microRNA）对Cx43的调控也逐渐成为热门的研究靶点[25-29]，大鼠大脑缺血后处理可以通过下调miRNA-1影响Cx43蛋白的重新分布[30]。
综上所述，本文首先发现了ER（+）的乳腺癌细胞中Cx43总蛋白、细胞膜蛋白的表达水平均高于ER（-）细胞，且ER（+）细胞中由Cx43形成的GJ功能显著强于ER（-）细胞。其次，在ER（+）细胞MCF-7中通过调控GJ功能，观察了对阿霉素抗肿瘤作用的影响。本研究可为阿霉素的临床扩大应用、ER（+）乳腺癌的临床治疗提供新靶点。
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