2018, Vol. 38
2. 中山大学附属第一医院东院 儿科，广东 广州 510700;
3. 中山大学附属第一医院内分泌科，广东 广州 510080
2. Department of Pediatrics, Huangpu Division of First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510700, China;
3. Department of Endocrinology, First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，而大血管并发症是其致死、致残最主要的原因[1]。高血糖引起血管内皮细胞（VECs）功能失调是血管病的始动因子[2-4]。探讨高血糖引起VEC损伤的病理生理机制对防治糖尿病血管病的发生极其重要。糖原合酶激酶-3（GSK-3）[5]及内质网应激（ERS）在糖尿病心血管并发症中的作用日益受到重视[6]。
GSK-3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，被认为是多种细胞事件和信号通路的调节者，包括GSK-3α和GSK-3β两个成员。与大部分的蛋白激酶不同，GSK-3在磷酸化状态时是不活动的。GSK- 3α结构中的Ser21或GSK-3β中的Ser9去磷酸化导致它们被激活并对各种刺激产生反应[7-8]。糖尿病肾病大鼠肾组织的GSK-3β活性增强，GSK-3β抑制剂可抑制GSK-3β活性，减轻肾组织的病理改变及尿蛋白量[9]。高糖引起H9C2细胞凋亡及GSK-3β活性增强，小干扰RNA沉默GSK-3β后能保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤[5]。在糖尿病大鼠，GSK- 3β抑制剂通过调控Nrf2/TrxR2信号通路保护肾脏对抗缺血再灌注引起的损伤[10]。有关GSK-3β在高糖损伤血管内皮细胞的作用及其机制尚未见相关研究。
内质网应激（ERS）是指某些因素使ER生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理状态。高浓度的葡萄糖能激活内皮细胞，但长期高血糖则导致持续的ERS[11]。适当程度的ERS对维持细胞的稳定是有利的，而长期的ERS则能引起细胞凋亡及发生许多疾病[12]。ERS在T2DM的VECs损伤中起着重要的作用[13-15]。高糖能引起人脐静脉内皮细胞（HUVECs）凋亡、ERS及内皮素-1生成增多；Mir-149-5P能通过抑制ERS（降低GRP78、CHOP表达）及增加抗凋亡蛋白（Bcl-2）表达等机制保护HUVECs对抗高糖引起的损伤[6]。在胰岛瘤细胞模型，ERS引起的凋亡与增加GSK-3β活性有关[16]。在脂多糖（LPS）诱发的肝损伤中，GSK-3β与促进ERS引起的凋亡有关[17]。因此，我们推测在高糖引起的VECs损伤中，可能存在GSK-3β与ERS相互作用，而且这种相互作用可能是高糖损伤VECs的一个重要的病理生理机制。
本研究拟建立高糖处理的HUVECs损伤模型，探讨GSK-3β与ERS是否存在相互作用；GSK-3β和ERS在高糖损伤血管内皮细胞中的多种作用，为深入阐明高糖对血管内皮细胞的损伤机制提供实验依据。
1 材料和方法 1.1 材料和试剂抗GSK- 3β、抗磷酸化（p）-GSK-3β（Ser9）、抗GRP78、抗CHOP和抗cleaved caspase-3抗体购自Cell Signaling；双氯荧光素（DCFH-DA）、罗丹明123（Rh 123）、Hoechst 33258染料、氯化锂（LiCl，GSK-3β的抑制剂）、4-苯基丁酸（4-PBA，ERS的抑制剂）购自SigmaAldrich；特级胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL；细胞计数试剂盒8（CCK-8）由Dojindo Lab（Japan）提供；DMEM培养基由Hyclone供应。HUVECs由中山大学实验动物中心细胞库供应。
1.2 细胞培养及实验分组在含5% CO2的37 ℃恒温培养箱中、采用含10% FBS的DMEM培养HUVECs，当细胞生长至约80%的融合状态时可进行实验。实验分为6组：（1）Con组：DMEM培养基作用HUVECs 24 h；（2）高糖（HG）组：40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h；（3）LiCl+ HG组：10 mmol/L LiCl预处理HUVECs 60 min，再予40 mmol/L葡萄糖作用24 h；（4）4-PBA+HG组：20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，再予40 mmol/L葡萄糖作用24 h；（5）LiCl组：10 mmol/L LiCl预处理HUVECs 60 min，再予DMEM作用24 h；（6）4-PBA组：20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，再予DMEM作用24 h。
1.3 GSK-3β、GRP78、CHOP和cleaved caspase-3蛋白水平测定HUVECs在60 mm培养皿中生长至约80%融合度时，给予不同的处理后加入细胞裂解液作用30 min后，高速离心10 min后取上清液进行蛋白定量（BCA法）。等量蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳分离后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉常温孵育1 h后加入Ⅰ抗稀释液[包括抗GSK-3β、抗pGSK-3β（Ser9）、抗cleaved caspase-3、抗GRP78、抗CHOP和GAPDH，浓度均为1:1000]，4 ℃作用过夜后加入Ⅱ抗稀释液（浓度为1:3000）孵育1.5 h。ECL法使PVDF膜显色，暗室中曝光到X线片上，凝胶成像扫描系统分析结果。实验重复5次。
1.4 细胞存活率测定在96孔板中培养HUVECs，当细胞生长至约80%的融合度时，按各分组处理后，吸去细胞培养液，PBS液冲洗3次，加入CCK-8溶液10 μL/孔，37 ℃恒温培养箱内孵育2.5 h，酶标仪上读取A 450 nm；细胞存活率按照以下公式计算：细胞存活率（%）=处理组A /对照组A× 100%。实验重复5次。
1.5 细胞凋亡检测HUVECs在24孔板中生长至约80%的融合度时，按照分组给予不同处理后，4%的多聚甲醛固定10 min，加入用Hoechst 33258染料稀释液，37 ℃温箱中作用30 min，荧光显微镜下可观察到：正常的细胞呈弥散均匀的低密度荧光，凋亡细胞则表现为细胞核呈现浓缩致密的固缩形态或颗粒荧光，随机照片记录5个高倍镜视野（放大200倍，以下同）。应用Image J 1.47i软件计算平均荧光强度（MFI），对每组数据进行统计分析。实验重复5次。
1.6 细胞内ROS水平测定HUVECs在24孔板中生长至融合度约80%时，经不同处理后，加入DCFH-DA染液后于37 ℃温箱中作用30 min，荧光显微镜（TE-2000 Nikon）下随机照片记录5个高倍镜视野，应用Image J 1.47i计算出绿色荧光的MFI（数值大小能间接反映ROS水平的高低），并对每组数据进行统计分析。实验重复5次。
1.7 线粒体膜电位（MMP）水平测定HUVECs在24孔板中生长至约80%的融合度时，按照分组给予不同处理后，加入Rh 123染液，37 ℃温箱中作用30 min，荧光显微镜下随机照片记录5个高倍镜视野，应用图像分析软件计算绿色荧光的MFI（数值大小可反映MMP的高低），并对每组数据进行统计分析。实验重复5次。
1.8 统计学处理利用SPSS 19.0软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示，单因素方差分析用于多个样本均数间的比较，结果有统计学意义再采用SNK-q检验进行均数间的两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 高糖激活人脐静脉内皮细胞GSK-3β40 mmol/L葡萄糖（HG）作用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）1~24 h对磷酸化（p）-GSK-3β的影响（图 1A、B）。当HG作用HUVECs 3 h可使p-GSK-3β的表达水平明显下降（反映GSK-3β被激活），与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.05）；随着作用时间的延长（6、9、12、24 h），呈显著的时间-剂量依赖关系，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）。在上述作用时间段，HG对HUVECs的GSK-3β表达水平无明显的影响。
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图 1 高糖对HUVECs的GSK-3β的激活作用 Figure 1 Effect of high glucose (HG, 40 mmol/L) exposure for 24 h on activation of glycogen synthase kinase- 3β (GSK- 3β) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). A: Expression levels of p-GSK-3β and GSK- 3βsemi- quantified by Western blot analysis; B, C: Densitometric analysis of p- GSK- 3β and GSK- 3β expression levels. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group (n=5) |
HG作用HUVECs 1 h可明显地增加GRP78的表达水平，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.05，图 2A、B）。随着作用时间的延长（3、6、9、12、24 h），HG对GRP78表达水平的促进作用呈显著的时间-剂量依赖关系，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）；HG作用HUVECs 3 h开始引起CHOP蛋白表达显著增多，随着作用时间的延长，这种作用呈显著的时间-剂量依赖关系（P < 0.01，图 2A、C）。
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图 2 高糖引起HUVECs的ERS Figure 2 HG (40 mmol/L) exposure for 24 h induces endoplasmic reticulum stress (ERS) in HUVECs. A: Expression levels of GRP78 and CHOP semi-quantified by Western blot analysis; B, C: Densitometric analysis of GRP78 and CHOP expression levels. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group (n=5) |
当HG作用HUVECs 24 h可明显地诱发ERS，GRP78和CHOP的表达水平明显升高（P < 0.01）。在HG产生作用前，应用10 mmol/L LiCl（GSK-3β抑制剂）预处理HUVECs 60 min，HG对GRP78和CHOP表达的促进作用明显减弱，与HG组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 3）。单独应用10 mmol/LLiCl处理HUVECs 60 min，HG对GRP78和CHOP表达水平影响不明显。
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图 3 活化的GSK-3β介导HG引起的HUVECs ERS Figure 3 Activated GSK-3β mediates HG-induced ERS in HUVECs. HUVECs were pre-treated with 10 mmol/L LiCl for 60 min before exposure to 40 mmol/L glucose (HG) for 24 h. A: Expression levels of GRP78 and CHOP semi-quantified by Western blot analysis; B, C: Densitometric analysis of GRP78 and CHOP expression levels. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs HG-treated cels (n=5). HG: High glucose |
HG作用HUVECs 24 h可激活GSK-3β，p-GSK-3β表达水平明显降低，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 4A、B）。在HG产生作用前，应用20 μmol/L 4-PBA（ERS抑制剂）预处理HUVECs 60 min，p-GSK- 3β表达水平升高，与单独HG组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）。单独20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60 min，p-GSK-3β表达水平的影响不显著。
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图 4 ERS参与高糖对HUVECs GSK-3β的激活作用 Figure 4 ERS is involved in HG-induced GSK-3β activation in HUVECs. HUVECs were pre-treated with 20 μmol/L 4-PBA for 60 min before exposure to 40 mmol/L glucose (HG) for 24 h. A: Expression levels of p- GSK- 3β and GSK-3βsemi-quantified by Western blot analysis. B, C: Densitometric analysis of p-GSK-3β and GSK-3β expression levels. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs HG-treated group (n=5). HG: High glucose |
HG处理HUVECs 24 h可引起明显的细胞毒性作用，细胞存活率明显降低，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 5）。在HG处理前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，可分别对抗HG引起的细胞毒性，使细胞存活率升高，与单独HG组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）。单独用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60 min，对细胞存活率影响不明显。
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图 5 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs存活率降低 Figure 5 GSK-3β and ERS are implicated in HG-induced decrease in HUVEC viability. HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre- treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min. Cell viability was detected using the Cell counting Kit-8 (CCK-8) assay. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs HG-treated group (n=5). HG: High glucose |
HG作用HUVECs 24 h可引起凋亡细胞数量显著增加，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 6A、B）。在HG作用前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能明显地减小凋亡细胞数量，与单独HG组比较，差异均具有统计学意义（P < 0.01）。用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA处理HUVECs 60 min，对凋亡细胞数量无明显的影响。HG处理HUVECs 24 h引起cleaved caspase-3[为凋亡效应器）表达水平明显升高，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 6C~F）]。在HG处理前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmmol/L 4-PBA预处理60 min，均能明显地减少cleaved caspase-3的表达水平，与HG处理组比较，差异均具有统计学意义（P < 0.01）。用10 m mmol/L LiCl或20 μmmol/L 4-PBA处理HUVECs 60 min，对cleaved caspase-3的表达水平无明显的影响。
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图 6 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs凋亡 Figure 6 GSK-3β and ERS participate in HG-induced apoptosis in HUVECs. HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min. A: Detection of cell apoptosis using Hoechst 33258 nuclear staining followed by fluorescence imaging; B: Percentage of apoptotic cells in different groups analyzed using Image J 1.47i software; C, E: Expression levels of cleaved caspase-3 semi-quantified by Western blot analysis; D, F: Densitometric analysis of cleaved caspase-3 expression levels. **P < 0.01 vs the control group; ##P < 0.01 vs HG-treated group (n=5). HG: High glucose |
应用DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧（ROS）水平。HG处理HUVECs 24 h，胞内DCFH-DA的MFI明显升高，与Con组比较，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 7A、B）。在HG处理前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能降低胞内DCFH-DA的MFI，与HG组分别比较，差异均具有统计学意义（P < 0.01）。10 mmol/L LiCl或20 μmol/L 4- PBA处理HUVECs 60 min，对胞内ROS水平表达无明显影响。
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图 7 GSK-3β和ERS参与高糖引起的HUVECs的氧化应激 Figure 7 GSK-3β and ERS are involved in HG- induced oxidative stress in HUVECs. HUVECs were treated with 40 mmol/Lglucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min. A: Intracellular ROS generation measured by 2'7-dichlorodihydrofluoresein diacetate (DCFHDA) staining followed by photofluorography; B: Quantitative analysis of the mean fluorescence intensity (MFI) using Image J 1.47i software. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs HG-treated group (n=5). HG: High glucose |
HG处理HUVECs 24 h引起线粒体损伤，线粒体膜电位（MMP）丢失，即Rh123荧光染料的MFI降低，与Con组相比，差异具有统计学意义（P < 0.01，图 8A、B）。在HG产生作用前，应用10 mmol/L LiCl或20 μmol/L4-PBA预处理HUVECs 60 min，均能拮抗HG引起的MMP丢失，与HG处理组分别比较，差异具有统计学意义（P < 0.01）。单独应用10 mmol/LLiCl或20 μmol/L4-PBA处理HUVECs 60 min，对MMP水平表达无明显影响。
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图 8 GSK-3β和ERS参与高糖引起的人脐静脉内皮细胞MMP丢失 Figure 8 GSK-3β and ERS contribute to HG-induced dissipation of mitochondrial membrane potential in HUVECs. HUVECs were treated with 40 mmol/L glucose for 24 h with or without pre-treatment with 10 mmol/L LiCl or 20 μmol/L 4-PBA for 60 min. A: MMP detected using the fluorescent dye Rh123; B: Quantitative analysis of the mean fluorescence intensity (MFI) using Image J 1.47i software. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs HG-treated group (n=5). HG: High glucose |
高血糖是引起糖尿病心血管并发症的最重要因素[17-19]。高血糖可通过引起细胞凋亡、细胞毒性、炎症、氧化应激、损伤线粒体等作用引起血管内皮细胞功能障碍[20-22]。内皮素-1[6]、氧化应激[21]、瘦素/瘦素受体通路[21]、JAK/STAT通路[22]及沉默信息调节子1[23]等参与高糖对血管内皮细胞的损伤。GSK-3（特别是GSK-3β）[5]及ERS[6]在糖尿病心血管并发症中的作用受到学者们的关注。
GSK-3β是导致胰岛素缺失和胰岛素抵抗的一个重要因素[24]。高糖引起H9C2心肌细胞GSK-3β活性增强，抑制GSK-3β能减轻高糖引起心肌细胞凋亡[5]。在高糖处理的HUVECs模型，GSK-3β活性增强、细胞凋亡增多、线粒体膜通透性丢失及细胞色素C释放增多[25]。该研究没有应用GSK-3β抑制剂或小干扰RNA沉默GSK-3β等方法进一步证实GSK-3β在高糖损伤HUVECs中的作用[25]。本研究观察到高糖能引起HUVECs多种损伤，表现为细胞存活率降低、凋亡细胞数量增多、ROS生成增多及MMP丢失；另外，高糖能增加HUVECs GSK-3β活性，这与Liu等人的报道相一致[25]。本研究应用GSK-3β抑制剂后，高糖引起的上述内皮细胞损伤明显减轻，提示GSK-3β参与高糖引起的细胞毒性、细胞凋亡、氧化应激及线粒体损伤，进一步证实了GSK-3β在高糖损伤血管内皮细胞中的作用[25]。
抑制ERS能减轻2型糖尿病心肌梗塞[26]。高糖能引起HUVECs发生ERS和细胞凋亡[27]。本研究证实糖能在HUVECs诱发ERS，表现为GRP78和CHOP蛋白表达增多，这与高糖作为应激刺激激发ERS有关。4- PBA能保护血管内皮细胞对抗高糖引起的损伤，表现为细胞存活率升高，凋亡细胞数量、ROS生成及MMP丢失减少，提示ERS参与高糖引起的血管内皮细胞多种损伤[28-30]，这为把ERS作为一个靶点来防治高糖引起的血管并发症提供了实验依据。
综上所述，在高糖处理的HUVECs，应用LiCl能抑制高糖引起的ERS，4-PBA能抑制高糖对GSK-3β的激活作用。这证明GSK-3β与ERS在高糖损伤HUVECs过程中，存在着相互作用，即激活的GSK-3β能加强ERS，ERS也能促进GSK-3β激活，这可能是高糖损伤血管内皮细胞的作用机制，为防治糖尿病血管并发症提供了一个新思路。
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