2018, Vol. 38
急性呼吸窘迫综合症（ARDS）是由非心源性的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭，病死率高[1-2]。其发病机制复杂，大量研究表明，肺部过度炎症反应及肺微血管内皮细胞屏障功能受损是ARDS发生、发展的关键因素[2-3]。
内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂，简称Vaspin（serpinA12）是一种新型脂肪细胞因子，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin家族成员之一[4]。研究发现Vaspin可调控血管内皮细胞的炎性因子、粘附分子及趋化因子的表达，且能对抗细胞凋亡，对血管内皮具有保护作用[5-6]。然而国内外尚未见Vaspin与ARDS关联及对其影响的相关报道。基于炎症反应爆发和肺泡毛细血管弥漫性损伤是ARDS的主要病理改变[2]，我们推测Vaspin可通过其介导的抗炎及血管内皮保护效应对ARDS肺损伤发挥保护性调控。
故此，本研究通过气管内滴注LPS建立小鼠ARDS模型，探究Vaspin对小鼠ARDS的保护作用，并进一步探讨其潜在的调控机制。
1 材料和方法 1.1 实验动物40只SPF级雄性C57BL/6小鼠（6~8周龄，体质量20.0±2.0 g），购自重庆医科大学动物实验中心，并自由饮食、普通光照饲养于重庆医科大学动物实验中心。
1.2 实验试剂脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）购自Sigma、PI3K抑制剂渥曼青霉素（wortmannin）购自solarbio公司、Vaspin购自novoprotein公司；RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）、PMSF及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技研究所；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自联科生物科技有限公司；髓过氧化物酶（MPO）测试盒购自南京建成生物工程研究所；SDSPAGE凝胶配制试剂盒购自碧云天生物科技研究所；预染Marker购于Thermo公司；β-肌动蛋白（β-actin）、Akt及p-Akt抗体购自bioworld公司，VCAM-1抗体购自abcam公司，caspase-3、cleaved caspase-3抗体购自万类生物公司；Super Sensitive TM即用型超敏免疫组化二抗试剂盒（鼠/兔）购自南京Bioworld生物科技有限公司，ECL检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。
1.3 ARDS小鼠模型建立40只小鼠随机分为对照组、模型组（LPS组）、Vaspin组、渥曼青霉素组（wortmannin组），每组10只。小鼠称重后，腹腔注射4%水合氯醛（0.2 mL/20 g）麻醉小鼠。LPS组、Vaspin组及wortmannin组小鼠通过气管插管按5 mg/kg剂量滴注无菌LPS（10 μg LPS溶于50 μL无菌生理盐水）建立ARDS模型，对照组给予等量无菌生理盐水。Vaspin组及wortmannin组于LPS注射后立即腹腔注射Vaspin（0.1 μg/kg）。wortmannin组分别于LPS注射前、后90 min给予PI3K抑制剂渥曼青霉素（0.06 mg/kg），Vaspin组给予等量无菌生理盐水。
1.4 苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠肺组织病理变化24 h后处死小鼠，取右下肺组织，4%多聚甲醛固定，制成5 μm石蜡切片，HE染色，光镜观察。
1.5 小鼠肺组织湿干比（W/D）评估肺水肿取小鼠左下肺组织，放置于事先称重的锡箔纸上称量肺湿重，将样本放置于60 ℃烤箱72 h至恒重后，称量其干重。根据公式计算肺湿干比（W/D）值。
1.6 小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）检测将1 mL无菌PBS反复灌注小鼠肺组织3次，收集BALF，确保回收率大于90%。并于4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清液，按BCA蛋白测定试剂盒说明测定BALF总蛋白含量。
1.7 小鼠肺组织MPO活性检测按MPO测试盒要求，测定肺组织匀浆中MPO活性。
1.8 ELISA检测肺组织中炎症因子水平取小鼠右肺组织，冰PBS漂洗后制备肺组织匀浆，按ELISA试剂盒要求测肺组织中IL-1β和TNF-α的含量。
1.9 免疫组织化学法（IHC）观察肺组织中血管细胞间粘附分子（VCAM-1）表达取右上肺组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，60 ℃烤片1 h后，按Super Sensitive TM免疫组化试剂盒要求操作：石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）微波炉抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，免疫性动物血清常温封闭，加入抗体VCAM-1（1:500）过夜孵育，37 ℃复温35 min，PBS漂洗，加入一抗放大剂室温孵育30 min，PBS漂洗后滴加辣根过氧化物酶（HRP）聚合物（二抗）室温避光孵育30 min，PBS漂洗后DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察，并记录。
1.10 Western blot法检测肺组织cleaved caspase-3和Akt磷酸化水平使用RIPA裂解液及PMSF提取小鼠肺组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白样品-80 ℃保存，并行聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），5%脱脂奶粉或者5% BSA封闭1 h，分别加入cleaved caspase-3抗体（1:500）、caspase-3抗体（1:500）、p-Akt抗体（1:800）、Akt抗体（1:800）及β-actin抗体（1:5000）4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min，共3次，加入相应HRP标记的二抗（1: 10 000）37 ℃孵育1 h，再以TBST洗膜10 min，共3次，最后ECL显色，凝胶成像，Quantity One软件分析各条带吸光度值。
1.11 统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。计量资料据采用均数±标准差表示，组间比较采用one-way ANOVA分析，各组均数间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 HE染色观察肺组织病理变化对照组肺组织结构清晰，肺泡间隔无增宽，肺泡腔未见炎性细胞及渗出物；LPS组见肺泡间隔增宽，肺泡腔内及间质充血水肿明显伴大量炎性细胞浸润；Vaspin组肺组织损伤明显减轻，间隔轻度增宽，肺泡腔内出血水肿减轻，炎性细胞浸润减轻；wortmannin组病理改变介于LPS组与Vaspin之间（图 1）。
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图 1 小鼠的肺组织病理改变 Figure 1 Pathological changes in the lung tissues (Original magnification: ×400) |
与对照组比较，LPS组、Vaspin组及wortmannin组小鼠肺组织W/D均显著增高（P < 0.05），其中Vaspin组小鼠肺组织W/D值较LPS组及wortmannin组明显减轻（P < 0.05，图 2）。
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图 2 肺组织湿/干重比、BALF中蛋白含量及肺MPO活性的测定 Figure 2 Lung wet/dry weight (W/D) ratio, total protein level in the BALF and pulmonary MPO activity in different groups (Mean±SD, n=3 or 4). *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs Vaspin group |
与对照组比较，LPS组、Vaspin组及wortmannin组小鼠BALF中总蛋白含量明显增高（P < 0.05），其中Vaspin组BALF中总蛋白含量较LPS组和wortmannin组明显降低（P < 0.05，图 2）。
2.4 小鼠肺组织MPO活性比较与对照组比较，LPS组、Vaspin组及wortmannin组小鼠肺组织MPO活性均显著增高（P < 0.05），其中Vaspin组小鼠肺组织MPO活性较LPS组及wortmannin组明显降低（P < 0.05，图 2）。
2.5 小鼠肺组织中炎症因子水平比较与对照组比较，LPS组、vaspin组及wortmannin组小鼠肺组织中IL-1β和TNF-α含量均有显著增加（P < 0.05），其中vaspin组肺组织中IL-1β和TNF-α含量较LPS组和wortmannin组均有显著降低（P < 0.05，图 3）。
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图 3 肺组织中IL-1β含量及TNF-α含量的测定 Figure 3 Levels of IL-1β and TNF-α in the lung tissue in different groups (Mean±SD, n=4). *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs Vaspin group |
各组小鼠肺组织血管内皮细胞均呈现阳性信号（棕黄色颗粒），即各组小鼠肺组织血管内皮均表达VCAM-1蛋白，其中对照组肺血管内皮细胞染色最浅，LPS组肺血管内皮细胞染色最深，呈深棕黄色，即VCAM-1表达显著升高（P < 0.05），而vaspin干预后，染色明显变淡，即VCAM-1表达显著下调（P < 0.05，图 4）。
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图 4 肺组织VCAM-1的表达检测 Figure 4 Expression of VCAM-1 in the lung tissue in different group (Immunohistochemical staining, × 400). A: Control group; B: LPSgroup; C: Vaspin group; D: Wortmannin group |
与对照组比较，LPS组cleaved caspase-3蛋白表达明显升高（P < 0.05），vaspin干预后，cleaved caspase-3明显下调（P < 0.05），而wortmannin组较vaspin组表达明显升高（P < 0.05）；与对照组、LPS组及wortmannin组相比，vaspin组小鼠肺组织中P-Akt表达水平明显上调（P < 0.05），而LPS组、wortmannin组较对照组表达明显下调（P < 0.05，图 5、6）。
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图 5 Cleaved caspase-3的蛋白水平检测 Figure 5 Protein level of cleaved caspase-3 in the the lung tissues in different groups determined by Western blotting (Mean ± SD, n=4). *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △ P < 0.05 vs Vaspin group |
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图 6 p-Akt的蛋白水平检测 Figure 6 Protein level of p-Akt in the lung tissues in different groups determined by Western blotting (Mean±SD, n=4). *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs LPS group; △P < 0.05 vs Vaspin group |
ARDS病死率高，治疗效果欠佳[7]，虽不是典型的血管性疾病，但研究表明，肺血管内皮细胞屏障及功能障碍是ARDS的重要发病机制[8]。近年来，大量研究证实多种脂肪因子（如Adiponectin、Omentin等）对ARDS发挥保护性调控[9-10]，其中新近发现的脂肪因子Vaspin因其抗炎、抗凋亡及抗氧化应激等作用对血管内皮有保护性作用[5-6, 11-12]。因此，我们通过气管插管滴注LPS建立肺内源性ARDS小鼠模型，探讨Vaspin对小鼠ARDS的保护作用。结果发现，Vaspin预处理能显著改善小鼠肺组织病理改变，并明显减轻肺水肿及降低BALF蛋白含量，说明Vaspin可减轻ARDS肺损伤并改善肺微血管通透性。MPO是中性粒细胞（PMN）聚集及活化的标志[13]，研究证实PMN活化后释放多种炎症介质，包括TNF-α、IL-1β等，可引发炎症级联，诱导炎症细胞浸润，增加肺微血管通透性，最终导致肺损伤[14-15]。本实验中，Vaspin干预后肺组织MPO活性，肺组织匀浆中IL-1β和TNF-α水平均明显降低，表明Vaspin对ARDS具有抗炎保护作用。另一方面，血管细胞间粘附分子（VCAM-1）主要由血管内皮细胞表达。正常生理条件下，肺血管内皮细胞不表达或者仅少量表达VCAM-1，内毒素、促炎因子等刺激致粘附分子大量表达，介导炎性细胞与肺血管内皮细胞粘附，损伤肺内皮细胞导致内皮细胞通透性增加，进一步导致肺组织的损伤[16-17]。经Vaspin干预后，VCAM-1的表达显著降低，表明Vaspin可以直接降低粘附分子的表达，减少炎性细胞与肺内皮细胞粘附聚集，从而减轻急性肺损伤。
肺内皮细胞过度凋亡将导致肺微血管屏障完整性缺失，在ARDS发生发展过程中起重要作用[18]，细胞凋亡作为细胞程序性死亡，受半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族的调节，其中caspase 3是多条凋亡通路的汇聚点，剪切型caspase 3（cleaved caspase-3）活化将导致细胞凋亡的发生，提示凋亡已进入不可逆阶段，检测cleaved caspase-3可间接发现细胞凋亡情况[19-20]。本实验通过对cleaved caspase-3蛋白的测定证实，vaspin干预后小鼠的cleaved caspase-3蛋白表达显著降低，提示vaspin可能对LPS致小鼠ARDS肺组织有抗凋亡保护作用。
磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及其靶蛋白-蛋白激酶B是细胞内重要的信号传导通路，可通过影响其下游多种效应分子的活性，对细胞凋亡、增殖等发挥重要作用[21]，近年来，大量体内外实验证实，PI3K/Akt信号通路在LPS诱导的急性炎症反应中发挥重要的负向调节作用[22-23]，而本课题组前期实验证实上调PI3K/Akt信号通路对ARDS有保护作用[9, 24]。研究发现，vaspin可上调PI3K/ Akt信号通路对游离脂肪酸诱导的内皮细胞起抗凋亡作用[6]以及激活PI3K/Akt/eNOS信号通路缓解高糖诱导的内皮祖细胞功能紊乱[25]。因此，我们大胆假设，vaspin可通过激活PI3K/Akt通路对ARDS发挥保护性调控，本实验中LPS组p-Akt蛋白水平降低，vaspin干预可明显上调肺组织p-Akt的表达。而PI3K抑制剂渥曼青霉素能阻断vaspin的保护效应及其引起的Akt磷酸化，表明vaspin可能至少部分通过上调PI3K/Akt信号通路改善肺微血管通透性，抑制肺部炎症及肺内皮细胞凋亡，从而对肺内皮细胞起保护作用，但其具体分子机制还需进一步研究。
综上所述，Vaspin可通过其介导的抗炎及血管内皮保护效应，对ARDS肺损伤发挥保护性调控，其可能机制为激活了PI3K/Akt信号通路，为ARDS的防治提供了新思路。
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