Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）是导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的元凶。HIV-1性传播是一个低效的传播途径，据报道，无任何保护措施的阴道性交的感染率大约为1/1000-1/10000 ^[1-2]，然而，约80%性传播案例都是由单个HIV-1变异毒株建立的新感染^[3-5]，这种病毒被称为初始传播（TF）病毒。研究表明^[6-8]，相对于HIV-1慢性感染患者血液中的病毒多样性，急性感染者血液内检测到的HIV-1病毒具有高度同源性，这说明“黏膜瓶颈”导致传播过程中病毒遗传多样性的显著减少，并在生殖道局部先天免疫反应的选择压力下，选择出少数能增加传播适应性的优势变异株。而存在于慢性感染患者体内的病毒准种与这种优势变异株（TF病毒）相对应，称之为慢性控制病毒（CC病毒）。对急性感染者及其匹配的慢性控制者的病毒序列分析发现，具有更近祖上基因的病毒会优先传播^[9]，该共有序列代表着启动感染的病毒基因组的一部分。TF病毒是建立新感染的病毒株，只有阻断TF毒株的感染，才能真正防止HIV-1的传播。

德国科学家Münch教授研究发现，精液源性病毒增强因子（SEVI）能显著增强HIV-1感染^[10]，这大大提高了HIV-1性传播的几率。一方面，男性感染者精液中的病毒种群主要由少数几种病毒毒株组成，不过精液中病毒滴度最高的毒株往往不是TF病毒，但可以确定的是这些高滴度的普通毒株与SEVI及TF、CC病毒共存于精液中^[11]。另一方面，精液作为传播介质，对HIV-1的黏膜传播起着举足轻重的作用。在以往SEVI增加HIV-1感染的研究中发现，SEVI广泛促进CXCR4、CCR5嗜性及双嗜性普通毒株感染靶细胞^[12]，但SEVI对TF、CC病毒感染的影响并不清楚。

ADS-J1是我们实验室发现的一个小分子阴离子化合物，具有抑制HIV-1进入靶细胞的作用^[12]。本研究中，我们扩增了一对TF及其相匹配的CC克隆病毒，先用SEVI分别与TF、CC混合后感染TZM-bl细胞，后用经ADS-J1处理的SEVI或ADS-J1直接分别与TF、CC病毒共孵后感染TZM-bl细胞，通过荧光素酶实验来检测SEVI对TF、CC病毒感染能力的影响，验证进入抑制剂ADS-J1对TF、CC病毒的直接抗病毒作用，及其对SEVI增强TF、CC病毒感染的拮抗作用。通过测定SEVI与ADS-J1混合处理后的Zeta电位，初步探索ADS-J1拮抗SEVI增强TF、CC病毒感染的作用机制，为HIV-1黏膜传播的机制提供参考。

293Tx、TZM-bl、CEMx174 5.25M7细胞株均来源于NIHRR；CH236 TF、CH236 CC感染性克隆病毒质粒皆由美国宾夕法尼亚大学Beatrice H. Hahn教授惠赠。

多肽PAP_248-286（纯度>95%）（北京中科亚光生物科技有限公司），用PBS配置成10 mg/mL的贮存液于4 ℃冰箱保存；RPMI 1640培养基，DMEM培养基，胰蛋白酶（含0.25% EDTA），胎牛血清（FBS），链霉素及青霉素（美国Gibco公司）；硫磺素T（Sigma）；ADS-J1（自主合成）；磷酸盐缓冲液PBS（广州捷倍斯生物科技有限公司）；转染试剂PEI（上海起福生物科技有限公司）；荧光素酶活性检测试剂盒（美国Promega公司）。

CO₂恒温细胞培养箱（美国Thermo公司），生物安全柜（新加坡ESCO公司），-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo公司），台式低温高速离心机（德国Eppendorf公司），Thermomixer恒温振荡仪（德国Eppendorf公司），Genios Pro型Tecan酶标仪（美国Tecan公司），倒置光学显微镜（日本Nikon公司），Zetasizer Nano ZS90（英国Malvern公司）。

多肽PAP_248-286贮存液用PBS稀释至2.5 mg/mL，于37 ℃、1400 r/min在恒温振荡仪上振荡48 h，使其聚集成为SEVI淀粉样纤维。SEVI溶液梯度稀释（400、200、100、50 μg/mL），立即加硫磺素T在酶标仪上检测荧光强度。激发波长450 nm（带宽5 nm），发射波长535 nm（带宽10 nm）。

生长良好的TZM-bl细胞用胰蛋白酶（含0.25% EDTA）消化后，离心收集细胞，以10⁴/孔、100 μL/孔接种于96孔板，37 ℃过夜；次日，每孔加入50 μL新鲜的含10% FBS的DMEM培养基；另加入50 μL不同浓度的SEVI稀释液；继续培养72 h，吸去培养基，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育4 h；弃上清，每孔加入150 μL的DMSO溶解紫色结晶，震荡10 min，用酶标仪在570 nm处检测吸光度。每组浓度设置3个复孔。SEVI对CEMx174 5.25M7悬浮细胞的毒性实验也采用类似的方法，采用RPMI 1640培养基（10% FBS，200 μg/mL G418，1 μg/mL嘌呤霉素、青霉素/链霉素）培养，细胞以10⁶ /孔、150 μL/孔接种于96孔板。培养72 h后，1500 r/min离心5 min，弃去上清，后续步骤同上。

293Tx细胞以5×10⁵/mL的密度接种于6孔细胞培养板，每孔接种2 mL，37 ℃过夜；次日，待细胞生长至80%，于转染前2 h更换新鲜的DMEM培养基，将CH236 TF和CH236 CC两种质粒（4 μg/孔）分别与PEI转染试剂（1 μg/μL）按3:1（质量比）混合，转染293Tx细胞；转染10 h后，弃去上清，加入新鲜的含10% FBS的DMEM培养基；继续培养48 h，离心，收集上清（即病毒原液），过滤后分装，置于-80 ℃冰箱，备用。

TZM-bl细胞以10⁴/孔、100 μL/孔接种于96孔板，37 ℃过夜；次日，CH236 TF和CH236 CC克隆病毒与系列稀释的SEVI溶液按1: 1体积比混合，室温下孵育10 min；混合物以100 μL/孔加入细胞中，只加培养基组作为空白对照，仅加病毒组作为阳性对照；感染3 h后，更换新鲜的含10% FBS的DMEM培养基；继续培养72 h后，按照荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测病毒滴度：弃去上清，每孔加200 μL PBS洗板1次，再加入50 μL细胞裂解液，振荡裂解20 min，移取40 μL细胞裂解后的溶液至96孔白色平底微孔板中，每孔加入70 μL荧光素酶底物（预先用水1: 1稀释），立即用酶标仪测定发光值。每组设置3复孔。ADS-J1对SEVI增强病毒感染的影响也用荧光素酶实验进行评估。ADS-J1系列稀释液与SEVI等体积混合，于37 ℃孵育15 min，5000 r/min离心10 min，弃去上清，用空白DMEM培养基重悬沉淀，与病毒等体积混合，室温下孵育10 min，其余步骤同上。ADS-J1直接的抗病毒作用同样用荧光素酶实验评估。ADS-J1系列稀释液与病毒等体积混合，室温下孵育10 min，其余步骤同上。仅加病毒、未加ADS-J1组的抑制率当作0，并作为阳性对照组。

ADS-J1系列稀释液（240、120、60、30 μg/mL）与SEVI（400 μg/mL）等体积混合，37 ℃孵育30 min，室温下5000 r/min离心5 min，弃去上清；用1 mL浓度为1mmol的KCl重悬沉淀，室温孵育10 min，将样品倾倒入Zeta电位检测池，使用Zetasizer Nano ZS90电位测定仪检测，每个样品重复检测3次。

直方图均采用Excel进行处理。采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示。数据分析采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较用LSD法，方差不齐则用Dunnett T3检验法，当P < 0.05时差异具有统计学意义。

淀粉样纤维能与硫磺素T特异性结合，诱导硫磺素T荧光的强吸收，而多肽单体则没有此作用。ThT实验结果（图 1）显示，PAP_248-286在PBS中形成淀粉样纤维SEVI，并呈浓度依赖性。

图 1(Figure 1)

图 1 ThT法检测PAP248-286在PBS中形成SEVI淀粉样纤维的情况 Figure 1 SEVI amyloid fibrils formation of PAP248-286 in PBS detected by ThT test. The fluorescence intensities of SEVI (0, 50, 100, 200, 400 μg/mL) were detected by Thioflavin T assay with excitation wavelength at 450 nm

对TZM-bl细胞中的MTT实验结果进行One-way ANOVA方差分析，P=0.250，方差齐性，SEVI浓度为0 μg/ mL的对照组与其他各浓度组之间的比较采用LSD检验法分析，P>0.05（图 2A），说明SEVI在0~50 μg/mL浓度范围内对TZM-bl细胞没有毒性作用。

图 2(Figure 2)

图 2 MTT法检测SEVI对TZM-bl细胞及CEMx174 5.25M7细胞的毒性作用 Figure 2 Cytotoxicities of SEVI on TZM-bl (A) and CEMx174 5.25M7 cells (B) analyzed by MTT assay

同样，对CEMx174 5.25M7细胞中的MTT实验结果进行One-way ANOVA方差分析，P值为0.213（P> 0.05），方差齐性，SEVI浓度为0 μg/mL的对照组与其他各浓度组之间的比较采用LSD法分析，P>0.05（图 2B），说明SEVI在0~50 μg/mL浓度范围内对CEMx174 5.25M7细胞没有毒性作用。

已有研究表明，精液蛋白PAP的不同片断形成的淀粉样纤维（如SEM1、SEM2、SEVI）能促进普通HIV-1毒株的感染^{[10, 13-14]}。本研究中，我们采用TZM-bl报告系统考察SEVI对TF和CC HIV-1病毒感染有无促进作用。先利用One-way ANOVA进行方差分析，CH236 TF、CH236 CC组P值分别为0.091、0.006。CH236 TF组方差齐性，采用LSD法两两比较；而CH236 CC组方差不齐，采用Dunnett T3检验法。结果表明，TF和CC毒株的结果类似，除了低浓度3.2 μg/mL组与空白对照组没有显著性差异（P>0.05，图 3A，图 3B）外，浓度为8、20、50 μg/mL的组均与空白对照组有显著性差异（P < 0.05，图 3A，图 3B），说明SEVI在较高浓度时能以浓度依赖的方式促进TF和CC HIV-1感染靶细胞。

图 3(Figure 3)

图 3 SEVI对CH236 TF和CH236 CC病毒感染的影响 Figure 3 Effect of SEVI on CH236 TF and CH236 CC virus infection. A: Enhancement fold of SEVI on CH236 TF analyzed by luciferase activity. B: Enhancement fold of SEVI on CH236 CC analyzed by luciferase activity. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs blank control

ADS-J1是具有拮抗SEVI促进普通HIV-1毒株感染的小分子阴离子化合物，前面的实验结果已经验证SEVI对TF和CC HIV-1病毒感染的促进作用，接下来，我们将SEVI的浓度设为20 μg/mL，考察ADS-J1拮抗SEVI增强CH236 TF和CC HIV-1毒株感染的情况。One-way ANOVA方差分析结果表明，CH236 TF组P值为0.112（P>0.05），方差齐性，采用LSD法两两比较，ADS-J1浓度在0.51、1.28、3.20、8.00、20.00 μg/mL时均显著拮抗SEVI增强CH236 TF病毒感染作用（P < 0.05，图 4A）。CH236 CC组P值为0.033（P < 0.05），方差不齐，采用Dunnett T3检验法，ADS-J1浓度在1.28、3.20、8.00、20.00 μg/mL时显著拮抗SEVI增强CH236 TF病毒感染作用（P < 0.05，图 4B）。此实验结果表明，ADS-J1拮抗SEVI增强TF和CC HIV-1感染靶细胞，并呈浓度依赖作用。

图 4(Figure 4)

图 4 ADS-J1拮抗SEVI增强CH236 TF和CH236 CC病毒感染 Figure 4 Antagonism of ADS-J1 on SEVI-mediated enhancement of CH236 TF and CH236 CC viruses in vitro. A: Enhancement fold of SEVI treated with ADS-J1 on CH236 TF analyzed by luciferase activity. B: Enhancement fold of SEVI treated with ADS-J1 on CH236 CC analyzed by luciferase activity. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs blank control

gp41是HIV-1跨膜糖蛋白，介导HIV-1与靶细胞融合，从而HIV-1进入细胞内。有研究表明，ADS-J1可以通过抑制gp41六螺旋束结构的形成，进而抑制HIV-1进入靶细胞的作用^[12]。我们设计了ADS-J1系列浓度（0.51、1.28、3.20、8.00、20.00、50.00 μg/mL），考察ADSJ1是否能抑制CH236 TF和CC HIV-1毒株感染TZMbl细胞。实验结果用One-way ANOVA进行方差分析，CH236 TF组、CH236 CC组的P分别为0.117、0.061（P> 0.05），方差齐性，采用LSD法两两比较，ADS-J1在浓度0.51、1.28、3.20、8.00、20.00、50.00 μg/mL时均显著抑制CH236 TF、CC HIV-1毒株感染靶细胞（P < 0.05，图 5）。以上结果表明，ADS-J1不仅能拮抗SEVI增强CH236 TF、CC HIV-1毒株感染作用，还可以直接抑制病毒感染靶细胞。

图 5(Figure 5)

图 5 ADS-J1抑制CH236 TF和CC HIV-1毒株感染 Figure 5 ADS-J1 inhibited the infection of CH236 TF and CH236 CC viruses in vitro. A: Inhibition (%) of CH236 TF viruses treated with indicated concentration of ADS-J1 analyzed by luciferase activity. B: Inhibition (%) of CH236 CC viruses treated with indicated concentration of ADS-J1 analyzed by luciferase activity. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs blank control

既然ADS-J1本身就能抑制TF和CC HIV-1感染，那么图 4中加入ADS-J1后，SEVI促感染作用的降低是两种作用的简单叠加，还是ADS-J1对SEVI的拮抗作用呢？SEVI淀粉样纤维促进HIV感染的作用机制是，纤维富含正电荷，能与带负电荷的病毒粒子结合，拉近病毒与靶细胞之间的距离，从而促进病毒感染^[14-15]。ADS-J1为小分子阴离子化合物，我们通过Zeta电位法探讨ADS-J1拮抗SEVI促感染作用的机制。淀粉样纤维富含正电荷，用不同浓度ASD-J1处理SEVI后，检测混合物的Zeta电位。结果显示，SEVI（400 μg/mL）电位为+20.9±0.36 mV，ADS-J1（30 μg/mL）电位为-4.2± 0.20 mV。SEVI所带的正电荷被ADS-J1呈浓度依赖性地中和，并在ADS-J1为60 μg/mL时逆转为带负电（图 6）。Zeta电位法的结果表明，ADS-J1能中和SEVI表面的正电荷。

图 6(Figure 6)

图 6 ADS-J1中和SEVI表面的正电荷 Figure 6 ADS-J1 neutralizes the positive charge of SEVI. Zeta potential of SEVI treated with serial concentration of ADSJ1 was detected by Zetasizer Nano ZS90

性传播已经成为HIV-1的最主要传播方式，生殖道黏膜、直肠或口腔黏膜组织为HIV-1的性传播提供了主要的感染位点^[16]，而建立黏膜新感染的毒株为TF病毒，约80%为单株TF感染。男性长期感染者血液内的病毒分泌到精液的过程中，病毒载量和多样性大大减少，但一些毒株仍然可以通过精液传播，可见黏膜瓶颈和先天性免疫并不能完全阻止病毒传播，反而选择出能打破这些屏障的TF优势变异株。研究表明，天然存在于精液中的SEVI能显著增加HIV-1感染，其在精液中含量高达42 μmol/L，约占精液固体蛋白的35% ^{[10, 15]}，我们猜测这也为TF传播提供了极有利的条件。目前，尚未有以生殖道为靶点来阻止HIV-1传播的药物上市^[13]，其中生殖道局部杀微生物剂是一种很有研发前景的药物，它可以通过直接灭活HIV-1、阻断HIV-1黏附及抑制病毒进入靶细胞，或抑制病毒在靶细胞内复制，增强阴道和子宫的天然免疫反应等多个靶点将HIV-1 “扼杀”在摇篮。然而，许多在体外证实有效的局部杀微生物剂，临床试验结果均以失败告终^[13]。如前所述，SEVI可能是导致杀微生物剂临床试验失败的罪魁祸首。因此，SEVI和TF、CC毒株可以作为HIV杀微生物剂研发的方向。

本研究中，首先我们在体外将PAP_248-286多肽溶解在PBS中，在37 ℃下剧烈震荡48 h，ThT实验表明，PAP_248-286单体浓度依赖性地形成了淀粉样纤维SEVI。剧烈震荡形成SEVI用于后续的病毒感染实验，但精液中SEVI的形成至今没有明确的机制，可能与多肽氨基酸残基间相互作用、介质疏水性、温度、pH、金属离子等有关^[17]。

针对HIV R5病毒的实验表明，大量带正电荷的SEVI犹如一张“大网”牢牢捕获带负电的病毒，并且可以降低病毒与细胞膜间的静电排斥，增加了病毒在细胞膜上的粘附率从而促进病毒与靶细胞的融合^[14]。然而，SEVI对TF和CC病毒感染能力的影响目前尚不清楚，虽然TF病毒的低糖基化^[20]导致它在黏液中相对容易迁移，可能难以被SEVI淀粉样纤维捕获，但是TF病毒的包膜糖蛋白几乎是普通HIV-1的2倍^[19]，带正电荷的SEVI可能对病毒与细胞膜上的融合极为有利，因此，我们猜测SEVI可能也会增加TF及其相匹配的CC病毒感染。本研究中，我们利用CH236 TF和CC感染性克隆转染293T细胞获得病毒，进一步的病毒感染实验表明，SEVI确实能增强TF、CC病毒感染靶细胞，增强倍数依次为11.6±0.7和8.9±0.7倍，增强的效果较普通R5毒株的效果弱，这一结果与精液增强病毒感染的结果类似（本课题组数据，未列出），这可能与不同病毒本身的感染能力、病毒稀释的倍数等因素有关。值得一提的是，TF和CC病毒本身的滴度也远低于普通的毒株，两者之间往往相差几个数量级。

ADS-J1是我们课题组采用高通量筛选得到的小分子化合物，它除了抑制SEVI的形成、降解成熟的SEVI，还通过靶向HIV-1 gp41、gp 120阻断病毒进入靶细胞，具有“三重”作用的ADS-J1有望作为先导化合物来研发以SEVI为靶点同时直接抑制病毒感染的杀微生物剂^{[12, 20-22]}。基于这些研究基础，我们预测ADS-J1也可以拮抗SEVI增强TF、CC毒株感染靶细胞的能力。为了证实这一猜测，我们首先将ADS-J1和SEVI在37 ℃下共孵育，然后与TF及CC病毒混匀后感染TZMbl细胞，结果证实ADS-J1可以拮抗SEVI增强TF及CC毒株的感染，且拮抗作用呈浓度依赖性。高浓度的ADS-J1甚至将病毒滴度降低至对照值以下，暗示ADSJ1不仅拮抗SEVI增强TF、CC病毒感染，可能还可以直接抑制TF、CC病毒感染靶细胞，接下来我们通过ADSJ1对TF、CC的抗病毒实验证明了这一猜测。如前所述，SEVI表面的正电荷是增强病毒感染的重要原因，ADS-J1是一种阴离子化合物，它能中和SEVI表面的正电荷。为进一步探索ADS-J1拮抗SEVI增强病毒感染的作用机制，我们用不同浓度的ADS-J1处理SEVI，检测其电位，结果证实ADS-J1能浓度依赖性地中和SEVI表面的正电荷。因此，我们认为，SEVI增强TF和CC病毒感染能力的作用机制与增强普通R5病毒感染能力的作用机制是一致的，而ADS-J1通过中和SEVI表面的正电荷而拮抗其增强作用。

本研究利用体外感染模型，初步证实了ADS-J1拮抗SEVI增强TF和CC病毒的感染能力及其作用机制，TF病毒作为有效建立新感染的毒株，我们认为这一结果比SEVI增强其他普通HIV-1毒株感染对于黏膜传播过程的了解更具参考意义。然而，鉴于体内环境的复杂性，需要进一步的体内实验或利用模拟体内环境的模型才能更好地了解TF病毒的传播机制，以寻求阻断TF病毒感染机体的有效方法。