2018, Vol. 38
2. 西北妇女儿童医院，陕西 西安 710000;
3. 中国科学院地球环境研究所黄土与第四纪地质国家重点实验室，陕西 西安 710075
2. Northwest Women and Children's Hospital, Xi'an 710000, China;
3. State Key Laboratory of Loess and Quaternary Geology, Institute of Earth Environment, Chinese Academy of Science, Xi'an 710075, China
可吸入颗粒物(PM)已成为日益受到重视的空气污染物，其中PM2.5对人类健康危害最为严重。而呼吸系统是PM2.5暴露和作用的主要靶器官，人群流行病学实验已证实了PM2.5暴露引起或促进了众多呼吸系统相关疾病的发生和发展[1-2]。而相关毒理学实验揭露了PM2.5引起呼吸系统损伤的作用机制主要与氧化应激、炎症反应有关[3]。
芍药苷作为中国传统中草药芍药的有效活性成分，是一种天然的抗氧化剂，具有抗炎、镇痛[4]，抗过敏[5]、抗纤维化[6]、免疫调节[7]、抗高血脂[8]、抗血小板聚集等作用[9]。芍药苷也对多种心肺细胞具有重要保护作用，能减轻脂多糖、过氧化氢及缺氧等所致的细胞损害，其机制可能也与芍药苷的抗氧化及抗炎症等作用相关[10-12]。为了减少PM2.5环境污染带来的危害, 本研究采用中医药“治未病”的思想，利用芍药苷的抗氧化功能来干预呼吸系统损伤，探索芍药苷对大气PM2.5造成呼吸系统相关疾病的潜在药用价值[13]，进而对其进行防治。
而芍药苷是否对经PM2.5悬浊液染毒的支气管上皮细胞有直接作用，国内外尚未见报道。因此本实验拟用人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)在浓缩大气PM2.5悬浊液染毒的同时使用不同浓度芍药苷进行干预，测定BEAS-2B细胞的细胞存活率及毒理学指标，如胞内MDA，ROS，研究不同浓度PM2.5及不同浓度芍药苷对支气管上皮细胞的交互影响。从细胞毒理学水平评价芍药苷对PM2.5染毒致支气管上皮细胞损伤的保护作用，探索其可能的保护作用及机制。
1 材料和方法 1.1 实验材料人支气管上皮细胞(BEAS-2B细胞)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Amresco)。芍药苷(索莱宝科技，分析纯，纯度>98%)。
KB-120F智能TSP-PM10中流量采样器(金仕达电子科技)、2.0 μm PTFE微孔滤膜(海成世过滤器材)、Infinire M200型酶标仪(Tecan)、倒置相差荧光显微镜(千欣仪器)、流式细胞仪(BD FACSCalibur)。
1.2 实验方法 1.2.1 PM2.5的准备方法2014年11月21日~2015年3月15日-，在西安交通大学医学部公共卫生学院卫法楼七楼进行采样，每天采样10 h，滤膜每2 d换1次。采样后将滤膜有尘面对折放入滤膜袋，并避光储存于-20 ℃冰箱中。将采集好的PM2.5的采样滤膜剪碎成若干块小片，将其完全浸入50 mL三蒸水中，进行超声分离，制备成颗粒物悬液，将悬液分装放置于-80 ℃低温冰箱中过夜，后置于SCientz-10ND真空冻干机进行除水处理，所得干燥灰色絮状颗粒物低温冰箱保存备用。将所得PM2.5颗粒装入冻存管中，后置于液氮罐中冷冻灭菌24 h。用1640培养基溶解所得颗粒物，使得最终浓度为2 mg/mL备用，然后置于-80 ℃保存。
1.2.2 指标测定方法用酶标仪进行MTT法测量；用流式细胞仪定量检测细胞内ROS水平；用倒置相差荧光显微镜观察细胞内ROS的分布；用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定细胞培养上清MDA的含量。
1.3 统计学分析方法本实验采用析因设计，有芍药苷干预浓度与PM2.5干预浓度两个因素，利用析因设计资料的方差分析比较芍药苷干预浓度与PM2.5干预浓度的主效应及交互效应，利用单因素方差分析比较芍药苷干预浓度单独效应。检验水准ɑ=0.05。
2 结果 2.1 不同浓度的PM2.5染毒对BEAS-2B细胞干预后MTT的测量结果用不同浓度的PM2.5对生长状态良好的细胞进行24 h干预，用MTT实验来评价PM2.5对BEAS-2B细胞生长繁殖的影响。PM2.5干预浓度与细胞存活率之间呈剂量-反应关系(r=-0.759，P=0.018)。PM2.5干预对BEAS-2B细胞存活率的影响呈低浓度(0.1 μ、1.0 μg/mL)促进增殖，高浓度(10、200、400、800 μg/mL)抑制增殖。PM2.5以100、200、400、800 μg/mL浓度干预BEAS-2B细胞24 h时，其细胞存活率与对照组(0 μg/mL)细胞存活率相比明显下降(P < 0.05，图 1)。
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图 1 不同浓度的PM2.5对BEAS-2B细胞存活率的影响 Figure 1 Effects of different concentrations of PM2.5 on the viability of BEAS-2B cells. Compared with the control group, *P < 0.05; Compared with the control group, #P < 0.01 |
用不同浓度的芍药苷对生长状态良好的细胞进行24 h干预，用MTT实验来评价芍药苷对BEAS-2B细胞生长繁殖的影响。在芍药苷低浓度(0.001、0.01、0.1、1.0 μmol/L)时，抑制该细胞增殖，0.01和0.1 μmol/L时，芍药苷显著降低BEAS-2B细胞存活率；高浓度(10、100、1000 μmol/L)时，促进该细胞增殖，芍药苷100 μmol/L浓度时可以显著提高BEAS-2B细胞存活率(P < 0.01，图 2)。
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图 2 不同浓度的芍药苷对BEAS-2B细胞增殖的影响 Figure 2 Effects of different concentrations of paeoniflorin on the viability of BEAS-2B cells. Compared with the control group, *P < 0.05; Compared with the control group, #P < 0.01 |
用不同浓度的PM2.5和不同浓度的芍药苷对生长状态良好的细胞进行干预，在干预24 h后用MTT实验来评价芍药苷对PM2.5所致BEAS-2B细胞的生长抑制的保护作用。以下是芍药苷干预浓度与PM2.5干预浓度的主效应、交互效应及单独效应分析结果(表 1)。
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表 1 芍药苷干预对PM2.5染毒BEAS-2B细胞存活率测定结果的影响 Table 1 Effect of paeoniflorin on the survival rate of BEAS-2B cells with PM2.5 exposure (Mean±SD, n=3) |
采用析因设计资料的方差分析，结果发现对于不同PM2.5干预浓度水平，细胞存活率随浓度上升而下降(P < 0.0001)。在不同浓度芍药苷干预时，细胞存活率随浓度上升而上升(P < 0.0001)，而芍药苷干预浓度与PM2.5干预浓度之间不存在显著的交互效应(P>0.05)。
2.3.2 不同芍药苷浓度对各PM2.5浓度组细胞存活率的影响对芍药苷干预进行单独效应分析，对于PM2.5的不同浓度组，均采用单因素方差分析比较芍药苷剂量组间细胞存活率的差异，结果表明其他PM2.5浓度组未见明显统计学差异，只有800 μg/mL PM2.5浓度组中，细胞存活率随着芍药苷浓度增加而上升(P < 0.05)。
2.3.3 不同浓度芍药苷对细胞存活率的影响利用Dunnett-t检验将芍药苷干预浓度逐一与对照组(0 μmol/L)进行多重比较，发现芍药苷1 μmol/L浓度组与对照组相比，细胞存活率明显增高(P < 0.05)；而在芍药苷10和100 μmol/L剂量组与染毒对照组比较时，细胞存活率均显著性增高(P < 0.0001)。
2.4 芍药苷对PM2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤的保护效应用不同浓度的PM2.5和不同浓度的芍药苷对生长状态良好的细胞进行干预，在干预24 h后细胞内ROS及细胞培养上清MDA含量结果如下。
2.4.1 不同浓度芍药苷对PM2.5诱导BEAS-2B细胞内ROS含量的影响采用析因设计资料的方差分析，ROS结果发现不同PM2.5干预浓度下，随浓度上升细胞内ROS含量增加(P < 0.0001)；不同浓度芍药苷干预时，细胞内ROS含量随浓度上升而减少(P < 0.0001)，而芍药苷干预浓度与PM2.5干预浓度之间；在细胞内ROS含量中存在显著的交互效应(P < 0.0001)。
对芍药苷干预进行单独效应分析，分别利用单因素方差分析比较每个PM2.5浓度组内芍药苷剂量与ROS含量的差异，发现在每个PM2.5浓度组，不同芍药苷剂量组间细胞内ROS含量随浓度上升而减少(P < 0.0001)；利用Dunnett-t检验进行芍药苷干预浓度之间的多重比较，使芍药苷(1.0，10，100 μmol/L)浓度组细胞存活率均数逐一与对照组(0 μmol/L)进行比较；发现三个芍药苷剂量组与染毒对照组比较时，细胞内ROS含量均显著性降低(P < 0.0001，表 2)。
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表 2 芍药苷干预对PM2.5染毒BEAS-2B细胞内ROS含量测定结果的影响 Table 2 Effect of paeoniflorin on the ROS content in BEAS-2B cells with PM2.5 exposure (Mean±SD, n=3) |
采用析因设计资料的方差分析，MDA结果发现不同PM2.5干预浓度下，随浓度上升细胞培养上清MDA含量增加(P < 0.0001)；不同浓度芍药苷干预时，细胞培养上清MDA含量含量随浓度上升而减少(P < 0.0001)；但在MDA的产生中不存在显著的交互效应(P>0.05)。
对芍药苷干预进行单独效应分析，分别利用单因素方差分析比较每个PM2.5浓度组内芍药苷剂量与细胞培养上清中MDA的差异，发现在(400、800 μg/mL)PM2.5浓度组，不同芍药苷剂量组间细胞培养上清中MDA含量随浓度上升而显著减少(P < 0.0001)；在(0 μg/mL)PM2.5浓度组，组间MDA含量随浓度上升而减少(P < 0.05)；利用Dunnett-t检验进行芍药苷干预浓度之间的多重比较，使芍药苷(1.0、10、100 μmol/L)浓度组细胞存活率均数逐一与对照组(0 μmol/L)进行比较，发现芍药苷(1.0 μmol/L)剂量组与染毒对照组比较时，细胞培养上清中MDA含量显著性降低(P < 0.0001)。芍药苷(10、100 μmol/L)剂量组与染毒对照组比较时，MDA含量均降低(P < 0.05，表 3)。
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表 3 芍药苷干预对PM2.5染毒BEAS-2B细胞MDA含量测定结果的影响 Table 3 Effect of paeoniflorin on MDA content in BEAS-2B cells with PM2.5 exposure (Mean±SD, n=3) |
利用荧光显微镜定性观察BEAS-2B细胞内ROS水平，发现了随着PM2.5浓度的增加，细胞内荧光强度增强，随着芍药苷浓度的增加，细胞内荧光强度明显减弱(图 3)。
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图 3 芍药苷处理对PM2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤的ROS水平的定性观察 Figure 3 Qualitative observation of ROS level in BEAS-2B cells with PM2.5 exposure and paeoniflorin treatment |
既往研究表明大气PM2.5对BEAS-2B细胞有着明显的细胞毒性，影响着细胞的生长繁殖[14-16]。本实验得到与既往研究类似的发现，PM2.5干预浓度与细胞存活率之间存在着剂量-反应关系，PM2.5具有明显的细胞毒性反应。但除此之外，从实验结果中亦发现PM2.5低浓度时能够刺激BEAS-2B细胞增殖，这可能与毒物兴奋作用有关，通过低剂量毒物对机体内稳态的微干扰，启动一系列修复和维持机制，如通过对转录因子和激酶的激活，增加细胞保护和修复性蛋白的表达。
由于既往研究中未曾发现研究芍药苷诱导BEAS-2B细胞毒性的实验，故对其处理阈剂量不甚清楚。故本实验采用不同浓度的芍药苷对生长状态良好的BEAS-2B细胞进行干预，在干预24 h后用MTT实验来评价芍药苷对BEAS-2B细胞的毒性作用。发现用不同浓度的芍药苷干预使得BEAS-2B细胞生长曲线为S型曲线，即芍药苷在低浓度时，抑制BEAS-2B细胞的生长增殖；在高浓度时，促进BEAS-2B细胞增殖。而结合析因方差分析及多重比较发现，在有PM2.5干预细胞时，随着芍药苷浓度的增加，细胞存活率显著升高，说明芍药苷对BEAS-2B细胞具有一定保护作用。其次，实验结果显示了不同浓度的芍药苷对不同浓度PM2.5诱导的BEAS-2B细胞损伤的保护作用。尤其在800 μg/mL PM2.5浓度染毒组中，芍药苷10 μmol/L干预的染毒组和100 μmol/L干预的染毒组细胞存活率与染毒对照组相比均显著性增高，说明芍药苷能够减轻PM2.5诱导的BEAS-2B细胞毒性，对高浓度PM2.5所致BEAS-2B细胞的生长抑制有一定的保护作用。
Yan等[13]曾体外培养BEAS-2B细胞，发现PM2.5干预能够明显地增加细胞内ROS的生成。同样本实验定量及定性地检测了BEAS-2B细胞内ROS水平，发现随着PM2.5浓度的增加，BEAS-2B细胞内ROS水平显著增加。而经芍药苷干预后，随着芍药苷干预浓度的增加，细胞内ROS含量显著下降。并在不同的PM2.5染毒浓度组中，各个芍药苷干预染毒组分别与染毒对照组相比，细胞内ROS均显著性降低。
此外，本研究还发现随着PM2.5浓度的增加，MDA的含量显著增高。这与Deng等用PM2.5干预人体外培养的A549细胞发现一致，PM2.5能够明显增加细胞培养上清中MDA的释放[17]，说明PM2.5诱导BEAS-2B细胞发生了氧化应激损伤。同样经芍药苷干预后，随着芍药苷干预浓度的增加细胞培养上清MDA含量显著下降。在不同浓度的PM2.5染毒浓度组中，与染毒对照组相比，细胞培养上清MDA含量也显著下降。
氧化应激是指机体在需要清除体内老化的细胞，或在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS产生过多，氧化程度超出氧化物的清除能力，机体氧化系统和抗氧化系统失衡, 导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，从而导致组织损伤[19-20]。既往研究表明，芍药苷具有很强的抗氧化作用，在细胞氧化应激损伤状态下，芍药苷可以通过降低细胞内ROS的生成，增加抗氧化物谷胱甘肽及超氧化物歧化酶的产生，同时激活抗氧化通路核因子E2相关因子2/血红素氧合酶1，诱导血红素氧合酶l基因的表达来保护内皮细胞的氧化损伤，抑制细胞凋亡[21-23]。中、高浓度的ROS可通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。细胞内ROS水平的增加就表明了氧化应激反应的进行。
而在生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化最终产物为MDA[24]。它可以间接测定膜系统受损程度，引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，在体外可影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性[25]。研究表明芍药苷能显著降低缺氧诱导的乳鼠心肌细胞产生的MDA[10]，从而抑制氧化亢进。细胞上清中MDA水平的增加就表明了细胞膜已经受损，细胞生长受抑制。在本实验中，芍药苷对BEAS-2B细胞中的氧化应激过程有了明显的干预效果，对细胞的氧化应激损伤具有显著保护作用。
综上所述，本文的主要发现首先是芍药苷在低浓度时抑制BEAS-2B细胞的生长增殖，在高浓度时促进BEAS-2B细胞增殖。其次，芍药苷对PM2.5所致BEAS-2B细胞的生长抑制有一定的保护作用，其机制可能与芍药苷明显减轻了PM2.5诱导的BEAS-2B细胞氧化应激损伤有关。
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