Notch信号通路广泛存在于高等生物中，是细胞命运决定和个体发育的关键信号通路之一。人和哺乳动物有4种Notch受体（Notch1-4）和5种配体（Jagged1、Jagged2和DLL1、DLL3、DLL4）^[1]。自2004年首次报道约50%的T细胞急性淋巴细胞白血病患者中发现Notch1基因突变^[2]以来，越来越多研究表明Notch信号通路的异常与多种肿瘤的发生发展密切相关^[3-6]。Notch信号通路已经成为了新的肿瘤诊断和治疗靶点^[7-9]。

胃癌是引起世界范围内癌症相关死亡的第三大原因^[10]，已有研究表明：Notch配体的异常表达与胃癌的发生发展密切相关。例如，Jagged1在弥散型胃癌和低分化型胃癌中显著过度表达，在T期、N期和TNM期的胃癌病人中检测到DLL4高表达^[11]；DLL4的过表达增强胃癌干细胞的自我更新能力，并且通过激活Notch1信号通路造成胃癌患者的不良预后^[12]，同时，研究发现在瘤内注射Jagged1和DLL4的siRNA可以抑制肿瘤生长^[13]。已有研究发现DLL3在小细胞肺癌^[14]，急性髓性白血病^[15]和大细胞神经内分泌瘤^[16]中过表达，人DLL3在肺腺癌患者中的高表达与其总体生存率下降有关^[17]。但是，DLL3在胃癌中的作用及机制尚不明确。最近，我们通过分析TCGA（The Cancer Genome Altas）数据库中393例人胃癌（GC）病人的DLL3基因突变、拷贝数变异中发现，人DLL3基因在5%的上述样本发生了的基因突变和拷贝数变异，UCSC（University of California, Santa Cruz）数据库的478例胃癌患者的RNAseq数据表明大部分患者的癌组织中DLL3表达量降低，少部分胃癌患者的癌组织中DLL3表达量增加，而Kaplan Meier生存分析表明DLL3高表达患者的生存时间降低，提示人DLL3可能与GC的发生发展密切相关，因此，有必要阐明DLL3介导的Notch信号在胃癌发生发展中的作用及分子机制。

目前未见到有关于人DLL3基因表达的报道，本研究在前期已表达人Notch配体DLL1^[18]、DLL4^[19]和Jagged 1 ^[20]的基础上，旨在构建人全长DLL3真核表达质粒，并在HEK293T细胞中获得人全长DLL3蛋白的表达，进一步转染AGS等3株胃癌细胞，探究过表达DLL3对胃癌细胞增殖的影响，采用特异性siRNA下调胃癌细胞中DLL3的表达，进一步验证DLL3对胃癌细胞增殖的影响。

人DLL3（NM_016941）cDNA克隆（DLL3/pOTB7）质粒（优宝生物）；载体pCMVTag4和HEK293T、GES-1、AGS、MGC803和MKN45细胞由本实验室保存；感受态大肠杆菌DH5α和JM109（Tiangen）。

TaKaRa Taq^TM、DL 5000 DNAmarker、pMD^TM 18-T Vector Cloning Kit、限制性核酸内切酶Sal Ⅰ、BamH Ⅰ、T₄ DNA连接酶、RNAiso Plus、割胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒（TaKaRa）；RT-qPCR试剂盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）；Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen）；人DLL3-siRNA（sc-62206），Control siRNA（sc-37007）（Santa Cruz）；小鼠抗人DLL3抗体（R&D Systems）；兔抗人GAPDH抗体、小鼠抗人β-actin抗体（Bioworld）；RIPA细胞裂解液、PMSF、170 000 protein marker、PVDF膜、EZ-ECL发光试剂、HRP标记的羊抗小鼠IgG、HRP标记的羊抗兔IgG等（弗德生物）；Brad ford蛋白检测试剂盒（碧云天）；引物合成、基因测序由广州艾基生物技术有限公司完成。

PCR仪(Veriti 96 well Thermal Cycler)，实时荧光定量PCR仪（ABI 7500）（Applied Biosystem）。

小牛血清（四季青）；DMEM培养基（Gibco）。

根据Genbank中人DLL3 (NM_ 016941.3)的基因序列，设计扩增人全长DLL3基因的PCR上下游引物，上游引物：5'-GCCACCATGGTCT CCCCACGGATGT-3'；下游引物：5'-TTTCACGGAC AGAATCGAGGAAGGGTA-3'；设计特异性实时荧光定量PCR（qRT-PCR）引物，以β-actin为内参检测DLL3在mRNA水平的表达，DLL3上游引物：5'-GACCCTC AGCGCTACCTTTT-3'；DLL3下游引物：5'-TACATCT TCAGGGCGATTCC-3'；β-actin上游引物：5'-TGGCA CCCAGCACAATGAA-3'；β-actin下游引物：5'-CTAA GTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

上述引物均由广州艾基生物技术有限公司完成。

以人全长DLL3/ pOTB7质粒为模板，通过PCR扩增人全长DLL3基因，PCR反应条件为95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min，34个循环；72 ℃ 15 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

切胶回收PCR产物，将纯化的PCR产物与pMD18-T（9:1）在T₄ DNA连接酶作用下，16 ℃连接30 min，转化感受态大肠杆菌JM109，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB-琼脂平板培养基上过夜培养，次日挑取白色的单菌落进行培养并提取质粒，将阳性质粒用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切回收人全长DLL3基因，并克隆至真核表达载体pCMV-Tag4。重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切和DNA测序进行鉴定。

用DMEM完全培养基（10% FBS）常规培养HEK293T细胞，每2~3 d传代1次。以2.5×10⁶/mL细胞接种到6孔板，待细胞生长到90%，按Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒说明书进行转染，同时转染空载体pCMV-Tag4作为阴性对照组，无转染质粒的HEK293T细胞作为空白对照组，转染24 h后消化各组细胞，提取细胞总RNA和蛋白质进行mRNA和蛋白水平鉴定。

重组人全长DLL3/pCMV-Tag4质粒转染HEK293T细胞24 h后，消化各组细胞并用PBS清洗3遍离心去除上清，提取细胞总RNA，测RNA浓度和纯度后按逆转录试剂盒说明完成逆转录。按照qRT-PCR试剂盒说明，以β-actin作内参进行DLL3 mRNA检测，总反应体系为20 μL并设置3个复孔，以超纯水为模板做阴性对照，反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

重组人全长DLL3/pCMV-Tag4质粒转染HEK293T细胞24 h后，消化各组细胞并用PBS清洗3遍离心去除上清收集细胞，用RIPA蛋白裂解液冰上裂解细胞，每5 min涡旋振荡1次，20 min后离心取上清，用Bradford法测定蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液5×loading buffer，沸水浴10 min，进行10% SDS-PAGE电泳（18 mA，90 min），蛋白上样量约为10 μg，电泳结束后200 mA恒流90 min转至PVDF膜，用含5%的脱脂奶粉的TBST（10 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，150 mmol/L NaCl，0.08% Tween-20）室温封闭1.5 h，分别加入小鼠抗人DLL3抗体和兔抗人β-actin抗体室温孵育30 min后4 ℃过夜，用TBST洗去未结合的抗体，再分别加入HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h；TBST洗去未结合二抗后用EZ-ECL发光试剂检测结果。

待胃癌细胞AGS、MGC803和MKN45及正常胃上皮细胞GES-1长到80%~90%时提取各细胞的总RNA，反转录为cDNA后进行qRT-PCR的检测，细胞总RNA制备和qRT-PCR步骤同1.2.4；同时用RIPA细胞裂解液（1:100加入PMSF）裂解细胞提取总蛋白，用小鼠抗人DLL3抗体检测DLL3蛋白的表达，细胞总蛋白制备和Western blot步骤同1.2.5。

重组质粒DLL3/pCMV-Tag4和载体质粒pCMV-Tag4分别按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒说明转染胃癌细胞AGS、MGC803和MKN45后，消化各组细胞并用PBS清洗3遍去除上清收集细胞，细胞总蛋白制备和Western blot步骤同1.2.5。Western blot检测DLL3可在AGS等3株胃癌细胞中过表达后，向96孔板中汇合度长至60%的AGS、MGC803和MKN45细胞转染重组质粒DLL3/pCMV-Tag4 48 h，去上清，每孔加入200 μL MTT工作液，于细胞培养箱中孵育2 h，去上清，加入200 μL DMSO充分溶解沉淀后使用酶标仪（490 nm）检测其吸光度（A）。

人DLL3-siRNA和Control siRNA分别按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒说明转染胃癌细胞MGC803和MKN45细胞，24 h后消化各组细胞并用PBS清洗3遍去除上清收集细胞，细胞总蛋白制备和Western blot步骤同1.2.5。Western blot检测DLL3在MKN45和MGC803胃癌细胞中表达下调后，向96孔板中汇合度长至60%的MGC803和MKN45细胞转染DLL3-siRNA和Control siRNA 48 h，去上清，每孔加入200 μL MTT工作液，于细胞培养箱中孵育2 h，去上清，加入200 μL DMSO充分溶解沉淀后使用酶标仪（490 nm）检测其吸光度（A）。

每项实验独立重复3次，应用统计学分析软件SPSS 20.0进行统计学处理，实验数据用均数±标准差表示，对于qRT-PCR结果，多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，α=0.05；对于MTT结果，采用两独立样本t检验，P < 0.05认为差异有统计学意义。

以人全长DLL3/pOTB7 cDNA为模板，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳电泳结果显示在1800 bp左右可见特异性目的条带（图 1A），与预期结果一致。用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切获得人全长DLL3基因并克隆至pCMV-Tag4，重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切鉴定，获得4300 bp和1800 bp的两条片段（图 1B），大小与预期相符，将酶切正确的阳性进一步进行DNA测序，测序结果经NCBI BLAST比对，显示读码框正确，将该阳性克隆命名为DLL3/pCMV-Tag4。

图 1(Figure 1)

图 1 全长人DLL3/pCMV-Tag4重组质粒的构建及鉴定 Figure 1 Construction and identification of the recombinant plasmid DLL3/pCMV-Tag4. A: PCR amplification of full-length human DLL3 gene. M: DL 10 000 DNA marker; 1: Human DLL3 gene; 2: Negative control. B: Restriction enzyme digestion of recombinant eukaryotic plasmid DLL3/pCMV-Tag4. M: DL 10 000 DNA marker; 1: DLL3/ pCMV-Tag4 plasmid; 2: DLL3/pCMV-Tag4 plasmid digested by BamH I and Sal I.

将人全长DLL3/pCMV-Tag4重组质粒和空载体pCMV-Tag4分别转染HEK293T细胞，无转染质粒HEK293T细胞作为空白对照。24 h后提取细胞总RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR检测。结果显示，相对于对照组，人全长DLL3/pCMV-Tag4重组质粒转染HEK293T细胞24 h后，人DLL3的mRNA的表达水平明显升高（图 2A）。人全长DLL3/pCMV-Tag4重组质粒转染HEK293T细胞24 h后，提取细胞总蛋白，利用小鼠抗人DLL3抗体检测目的蛋白的表达，结果显示在约78 000处有一条特异性目的条带的表达，而对照组则未检测到目的条带（图 2B），说明DLL3/pCMV-Tag4重组质粒在HEK293T细胞中表达。

图 2(Figure 2)

图 2 人DLL3在HEK293T细胞中表达 Figure 2 Expression of DLL3 in HEK293T cells. A: Analysis of expression of human DLL3 mRNA by qRT-PCR (**P < 0.01 vs HEK293T cells); B: Analysis of expression of full-length human DLL3 protein by Western blotting.

待胃癌细胞AGS、MGC803和MKN45及正常胃上皮细胞GES-1细胞长到80%~90%提取各细胞的总RNA，反转录为cDNA后进行qRT-PCR的检测，同时用RIPA蛋白强裂解细胞提取总蛋白，用小鼠抗人DLL3抗体检测人全长DLL3蛋白的表达。结果显示：相对于GES-1，人DLL3 mRNA在AGS等3株胃癌细胞中表达水平显著升高（图 3A）；进一步的Western blot表明：人DLL3在3株胃癌细胞中的表达量均高于GES-1（图 3B），与qRT-PCR结果相符。

图 3(Figure 3)

图 3 人DLL3基因在正常胃上皮细胞GES-1和胃癌的表达分析 Figure 3 Expression of human DLL3 gene in normal gastric epithelial cells GES-1 and 3 gastric cancer cell lines. A: Analysis of relative expression of human DLL3 mRNA by qRT-PCR (*P < 0.05, **P < 0.01 vs GES-1 cells); B: Analysis of expression of human full-length DLL3 protein by Western blotting.

在3株胃癌细胞进行DLL3的过表达，通过Western blot检测DLL3蛋白的表达，结果显示：转染DLL3/pCMV-Tag4后，在大约68 000和78 000处有两条特异性目的条带，而转染空载体对照组只有1条68 000的目标条带，说明DLL3在胃癌细胞过表达成功（图 4A），之后我们进行了MTT实验以检测DLL3蛋白的过表达对细胞增殖的影响，结果显示，DLL3的过表达促进了胃癌细胞的增殖（图 4B）。

图 4(Figure 4)

图 4 过表达人全长DLL3蛋白对胃癌细胞增殖的影响 Figure 4 Effect of over-expression of DLL3 on gastric cancer cell proliferation. A: Analysis of over-expression of human full-length DLL3 protein in gastric cancer cells by Western blotting; B: Proliferation of gastric cancer cells after over-expression of human full-length DLL3 protein (*P < 0.05 vs EV group). EV: Gastric cancer cells transfected by pCMV-Tag4 vector; DLL3: Gastric cancer cells transfected by DLL3/pCMV-Tag

在胃癌细胞MGC803和MKN45中转染特异性人DLL3-siRNA下调DLL3的表达，通过Western blot检测DLL3蛋白的表达，结果显示：转染24 h后，同control siRNA组相比，DLL3-siRNA转染组中DLL3表达明显减少，表明采用特异性人DLL3-siRNA在上述胃癌细胞中成功下调DLL3表达（图 5A），进一步的MTT结果显示：下调DLL3抑制了上述胃癌细胞的增殖（图 5B）。

图 5(Figure 5)

图 5 下调人DLL3基因的表达对胃癌细胞MGC803和MKN45增殖的影响 Figure 5 Effect of down-regulation of DLL3 on proliferation of MGC803 and MKN45 cells. A: Analysis of the expression of full-length DLL3 protein in MGC803 and MKN45 cells after transfection with specific human DLL3-siRNA by Western blotting; B: Proliferation of gastric cancer cells after DLL3-siRNA transfection (*P < 0.05 vs control siRNA group).

人DLL3配体是由619个氨基酸组成的单次跨膜蛋白，其完整结构包含1个DSL结构域、1个胞内结构域和6个表皮生长因子样结构域。已有研究表明：DLL3可能抑制Notch受体介导的信号通路，这同DLL1和DLL4显著不同。例如DLL3不与相邻细胞表达的Notch受体结合或者激活Notch受体^[21]，反之当DLL3与其他Notch信号通路成员在细胞表面共表达时会抑制其他配体激活Notch信号通路^[22]。在原发性肝细胞癌中，检测到DLL3基因发生甲基化沉默，当在这些癌细胞系中加入去甲基化药物或者导入外源性DLL3基因，则诱导癌细胞的凋亡^[23]，在晚期神经内分泌瘤大鼠模型中，一种DLL3靶向抗体药物（SC16LD6.5）能够清除大鼠体内的肿瘤起始细胞^[16]，最新研究发现，DLL3在超过80%的小细胞肺癌患者中均有高表达，Ⅰ期临床研究表明：使用Rova-T（抗DLL3蛋白抗体偶联细胞毒素Tesirine）治疗小细胞肺癌表现出良好的抗肿瘤活性^[24]。因此，作为一个有潜在临床诊断和治疗价值的靶点，对DLL3在胃癌中的作用及其分子机制的深入研究具有重要价值。

在本研究中，我们首先通过酶切和测序分析表明成功构建了人全长DLL3/pCMV-Tag4重组质粒，当转染HEK293T细胞后发现：相对于转染空载体组，人全长DLL3/pCMV-Tag4重组质粒转染HEK293T细胞后，DLL3的mRNA水平显著提高（P < 0.05），进一步的Western blot结果显示在大约78 000处有DLL3-Flag融合蛋白特异性条带，表明人DLL3在293T细胞后获得表达。HEK293T细胞是人源化的细胞系，可对表达的目的蛋白进行翻译后修饰，有利于获得具有天然构象的重组蛋白，而pCMV-Tag4中有Flag表达标签，便于后续亲和纯化。

前期我们通过分析TCGA数据库和UCSC数据库提示人DLL3可能与胃癌的发生发展密切相关。为此，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了DLL3在正常人胃上皮细胞GES-1和人胃癌细胞中的表达差异。结果显示，相对于GES-1，DLL3在AGS等3株胃癌细胞中表达升高（P < 0.05），其中DLL3在AGS中表达量最高，在MKN45中表达最低。为了进一步探究DLL3在胃癌中的作用，我们在AGS等3株胃癌细胞中进行DLL3的过表达，Western blot结果显示：人全长DLL3/pCMVTag4重组质粒转染上述3株胃癌细胞后，在约68 000和78 000处有两条特异性目的条带，而转染pCMV-Tag4空载体对照组只在68 000有一条目标条带，表明在AGS等3株胃癌细胞不仅检测到有表达内源性的人DLL3，而且，转染DLL3/pCMV-Tag4后获得外源性DLL3的表达。MTT实验结果表明：当人DLL3在AGS等3株胃癌细胞中过表达后均可以促进胃癌细胞的增殖（P < 0.05）。为了进一步验证这个结果，我们选择MKN45和MGC803细胞系，采用特异性人DLL3-siRNA下调上述胃癌细胞中DLL3的表达，Western blot结果表明特异性人DLL3-siRNA转染胃癌细胞后下调胃癌细胞中DLL3蛋白的表达，同时MTT结果显示：下调DLL3蛋白的表达均可抑制胃癌细胞的增殖（P < 0.05）。

综上，本研究成功在HEK293T细胞中获得人DLL3的表达，过表达DLL3则促进胃癌细胞的增殖，表明人DLL3介导的Notch信号通路可能在人胃癌发生发展中扮演重要作用。