MCM家族是生物体DNA复制过程中的必需蛋白，该家族包括7个成员：MCM2-MCM7及MCM10，其中MCM2-7是真核细胞中启动DNA复制的关键蛋白^[1]。MCM3蛋白能直接与cyclin D1结合，调控细胞增殖^[2-3]。在人类多种肿瘤细胞中，MCM3过度表达^[4]，高于正常组织。MCM家族在肿瘤细胞中的表达情况已证实是一种癌症前诊断、治疗后的可靠标记蛋白^[5]。同一时间抑制多种MCM蛋白^[6]，在相同的肺癌细胞系中可表现出显著的协同抑制作用。在细胞周期过程中，MCM7参与并启动DNA复制，调节细胞增殖^[7]。经研究表明，CDC45是DNA起始复合物的建立、复制叉染色体解旋及DNA合成的必须蛋白^[8]，也是G1期到S期转变过程中的关键因素，可作为解旋酶辅助因子^[9]。CDC45与MCM2-7、GINS形成真核细胞中的复制解旋酶CMG ^[10]。CDC45参与细胞的表达调控，在多种肿瘤细胞中，CDC45的表达量比在正常细胞中高^[11]。

鱼藤素（Deguelin），鱼藤酮的衍生物，来自非洲软木（Mundulea sericea，豆科）^[12]。鱼藤素通过调节不同的途径，在体内、外各种类型癌症中都能表现出显著的抗肿瘤增殖活性。鱼藤素通过阻断抗凋亡途径，如PI3K-Akt、IKK-IκBα-NF-κB、AMPK-mTOR-survivin来诱导细胞凋亡，同时通过调节p27-cyclinE-pRb-E2F、HIF-1α-VEGF来抑制肿瘤细胞的增殖和恶性转变^[13]。鱼藤素通过作用于VEGF，抑制肿瘤增长，且呈浓度依赖性^[14]。

尽管已有大量文献报道鱼藤素的多种抗肿瘤机制作用，但鱼藤素对MCM3-CDC45的影响尚未见报道。因此，为进一步探究鱼藤素的抗肿瘤作用，本文选取MCF-7乳腺癌细胞和H1299肺癌细胞，探讨不同浓度的鱼藤素对其生长的抑制效果，并首次考察鱼藤素对MCF-7、H1299细胞中MCM3和CDC45 mRNA表达变化的影响，研究鱼藤素能否通过对MCM3-CDC45进行调控，从而来抑制癌细胞的增殖作用。

乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞H1299均由北京大学深圳研究生院林硕教授实验室提供；

DMEM培养基、1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；胎牛血清、新生牛血清和accutase消化液均购自GIBCO；MTT、DMSO购自sigma；Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen；PCR八联管购自BIO-RAD公司。

以10⁴/孔的密度将MCF-7、H1299细胞接种于96孔板中。在相应培养孔内加入不同浓度（0.25、0.5、1、5、10、30、50 µmol/L）的鱼藤素100 μL，每组设4个复孔，在培养箱中分别培养48、72、96 h。到达各自时间点后，弃去培养基，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃下避光孵育4 h。弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，完全溶解结晶物，酶标仪590 nm处测吸光度A。抑制率=（A_对照组－A_实验组）/A_对照组×100%。

以10⁴/孔密度将MCF-7、H1299细胞接种于96孔板，每孔100 μL，在CO₂培养箱中培养36 h，在相应培养孔内加入100 μL不同浓度（1、10 µmol/L）鱼藤素，每组设3个复孔。对照组加入培养液，每孔100 μL。培养72 h后，在光学显微镜下观察细胞形态。

取对数生长期的MCF-7及H1299细胞，接种到6孔培养板，每孔接种2 mL、密度为2×10⁵的细胞悬液。培养24 h后，将5、10 μmol/L的鱼藤素分别加入MCF-7、H1299细胞中，每组设3个复孔，对照组细胞加入2 mL培养液。培养72 h，弃上清，PBS缓冲液洗2次。加入Trizol细胞裂解液，每孔300 μL，室温放置5 min使其充分裂解，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。取上清，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s后，室温静置5 min，样品自然分相。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，小心吸取含RNA的上层水相至另一离心管中。加入等体积异丙醇，小心混匀后于室温静置10~20 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。弃上清，向RNA沉淀中加入1 mL 75%乙醇，温和振荡，洗涤沉淀。4 ℃，12 000 r/min离心5 min，弃上清。室温晾干10 min，加30 μL RNase free H₂O溶解。用Nanodrop仪检测RNA的纯度和浓度。

通过NCBI GenBank数据库，获得目的基因cDNA的序列，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，以GAPDH为内参基因。引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 Real-time PCR引物设计 Table 1 Primer for real-time PCR Primer name Primer sequence (5'-3') MCM3 (forward) GAAGGCGAGGAATGTTGG MCM3 (reverse) GTGGGATGGGAAGTAGGG CDC45 (forward) GGGAGTGGTATAATAGGG CDC45 (reverse) AGTGAGTTCCAGGACAGC GAPDH (forward) GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH (reverse) GAAGATGGTGATGGGATTTC

表 1 Real-time PCR引物设计 Table 1 Primer for real-time PCR

按照Prime Script^® RT reagent Kit试剂盒操作说明进行RT反应，配制RT反应液：5× Prime Script TM Buffer 4 µL，Prime Script TM Enzyme Mix1 2 µL，Oligo dT Primer（50 µmol/L）1 µL，Random 6 mers（100 µmol/L）1 µL，加入RNA样品，Rnase Free dH₂O加至总体积为20 µL，其中20 µL的反应体系可最大使用1 µg的Total RNA。反转录条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。所得cDNA产物置于-20 ℃保存。

反应体系的制备：SYBR Premix Ex Taq^TMII（2×）12.5 µL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 µL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 µL，DNA模板2 µL，dH₂O 8.5 µL。用ABI PRISM7300 Real-Time PCR System进行反应。扩增条件：预变性：95 ℃ 30 s，循环1次；PCR反应：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次；融解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃，60 s，95 ℃ 15 s，循环1次。利用2^—△△Ct法对qPCR结果进行数据分析。△Ct（域循环）=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；△△Ct=△Ct（给药组）-△Ct（对照组）；差别倍数=2^—△△Ct，正常对照组的数值均为1。

利用SPSS 19.0软件来进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，组间数据比较采用单因素方差分析，P < 0.05则差异具有统计学意义。

0.25、0.5、1、5、10、30、50 µmol/L的鱼藤素作用于MCF-7细胞48、72、96 h后，与对照组相比，MCF-7癌细胞存活率降低，增殖明显受到抑制，具有显著性差异。且该抑制效果呈现浓度和时间依赖性（图 1）。鱼藤素处理MCF-7细胞48、72、96 h的IC₅₀分别是9、3和2 µmol/L。

图 1(Figure 1)

图 1 不同浓度的鱼藤素作用MCF-7细胞48、72 h和96 h的存活率 Figure 1 MCF-7 cell viability following treatments with different concentrations of deguelin for different time. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

0.5、1、5、10、30、50及100 µmol/L的鱼藤素作用于H1299细胞48、72、96 h，其抑制率亦呈浓度-时间依赖性，鱼藤素处理96 h后，H1299细胞的IC₅₀是2 µmol/L；鱼藤素浓度0.5~10 µmol/L，处理96 h后，H1299细胞抑制率是29.8%~59.2%（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 不同浓度的鱼藤素作用H1299细胞48、72 h和96 h的生长抑制效果 Figure 2 H1299 cell viability following treatments with different concentrations of deguelin for different time. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group.

与对照组相比，观察鱼藤素作用72 h后MCF-7细胞的生长状态，对照组细胞生长分布密集，贴壁好，形态规则；1 µmol/L鱼藤素处理后，细胞数量减少，大部分细胞状态良好，仅少部分细胞贴壁能力减弱；10 µmol/L鱼藤素处理后，大部分细胞死亡，细胞不贴壁，细胞数量显著减少（图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 鱼藤素对MCF-7生长状态的影响 Figure 3 Morphological change of MCF-7 cells treated with different concentrations of deguelin. A: Control; B:1.0 µmol/L deguelin; C: 10 µmol/L deguelin.

对照组H1299细胞生长状态良好，呈梭状，细胞形态饱满，贴壁生长；5 µmol/L鱼藤素处理后，H1299细胞形态变小皱缩，生长分散，细胞数量减少；30 µmol/L鱼藤素处理后，细胞数目明显减少，形态不规则，不贴壁，死亡细胞数量明显增多（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 鱼藤素对H1299生长状态的影响 Figure 4 Morphological changes of H1299 cells treated with different concentrations of deguelin. A: Control; B: 5 µmol/L deguelin; C: 30 µmol/L deguelin.

提取对照组与处理组细胞的总RNA，通过反转录成cDNA，设计MCM3、CDC45引物，以GAPDH为内参基因，进行RT-PCR扩增反应，扩增曲线形态平稳光滑，各平行组溶解曲线峰单一，峰度重合性良好，显示扩增的产物单一，特异性好，数据可靠，可以重复。

10 μmol/L鱼藤素处理MCF-7细胞72 h后，MCM3及CDC45 mRNA有明显下调。与对照组相比，鱼藤素处理组的MCM3 mRNA表达量是对照组的40%，下调了60%，CDC45 mRNA的表达量是对照组的39%（图 5）。5 μmol/L鱼藤素处理H1299细胞72 h后，鱼藤素处理组的MCM3 mRNA表达量下调了54%，CDC45 mRNA的表达量下调了62%（图 6）。

图 5(Figure 5)

图 5 荧光定量PCR检测10 μmol/L鱼藤素处理MCF-7细胞 72 h MCM3、CDC45 变化情况 Figure 5 Expression change of MCM3 and CDC45 in MCF-7 cells treated with 10 μmol/L deguelin for 72 h. P < 0.001 vs control group.

图 6(Figure 6)

图 6 荧光定量PCR检测5 μmol/L鱼藤素处理H1299细 胞72 h MCM3、CDC45变化情况 Figure 6 Expression change of MCM3 and CDC45 in H1299 cells treated with 5 μmol/L deguelin for 72 h. P < 0.001 vs control group.

研究表明，鱼藤素对人类多种癌症有很好的抑制作用，如乳腺癌、结肠癌、皮肤癌和胃癌等。体外实验发现，鱼藤素对NSCLC细胞系具有抗增殖和诱导凋亡的活性。作为一种天然异黄酮类化合物，鱼藤素通过抑制ETC（线粒体电子传递链）的泛醌氧化还原酶（复合体I）来抑制细胞的呼吸作用^[15]。已报道^[16]，鱼藤素可消耗Hsp 90受体蛋白，其中包括Akt，survivin及Cdk4。其原因为，鱼藤素可直接与Hsp 90结合并抑制其活性，导致泛素介导的Hsp 90受体蛋白降解，Hsp 90是一种分子伴侣，许多受体蛋白在癌症发展、肿瘤血管生成和肿瘤耐药性中起到了关键作用。此外，鱼藤素可通过下调特定细胞存活蛋白诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，包括Akt和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等^[17]。最新研究发现，鱼藤素能够介导胰腺癌的自噬抑制作用，提高其他药物对癌细胞的敏感性^[18]。鱼藤素可通过下调HK2介导的糖酵解抑制NSCLC细胞的增殖^[19]。

本文首次研究了鱼藤素对MCM3-CDC45 mRNA表达的影响。首先运用MTT试验研究了鱼藤素抑制MCF-7、H1299细胞的增殖作用。结果显示，鱼藤素能诱导细胞凋亡并呈一定的浓度时间依赖性。根据数据分析得知，鱼藤素能明显抑制MCF-7及H1299细胞增殖。此外，在光学显微镜下，观察到MCF-7和H1299细胞处理前后的形态变化，可直观地显示鱼藤素对MCF-7及H1299细胞具有明显凋亡诱导效应，且随着鱼藤素浓度升高，死亡细胞数量也明显增多。

控制DNA复制和控制DNA复制检查点是维护基因组稳定、预防治疗人类癌症的关键。MCMs ^[20](包含MCM2-7)、CDC45以及GINs被称为CMG，是DNA解旋酶的关键因素。DNA复制过程紊乱将导致基因组的不稳定及细胞的恶性转化，从而促进肿瘤的发生。MCMs对复制检查点具有调节作用，因此被认为是DNA损伤反应的一个重要组成部分^[21]。研究表明，MCM3在多种人类癌症细胞中过度表达，高于正常组织中的表达量，MCM蛋白水平可反应细胞的增殖情况^[22]。此外，生物信息学分析发现，CDC45与细菌RecJ中DHH域有相似的N端氨基酸序列（5'-3' ssDNA核酸外切酶），可对DNA进行重组修复^[23]。为了研究鱼藤素是否通过调控MCM3-CDC45的表达量发挥抑制MCF-7及H1299细胞增殖作用，采用荧光定量PCR法检测鱼藤素对MCF-7、H1299细胞中MCM3-CDC45表达量的影响，结果证实，鱼藤素下调了MCM3-CDC45 mRNA表达。已证实，MCM3的裂解最早出现于凋亡细胞内，因此可以推断其在细胞凋亡过程中具有重要的意义。鱼藤素通过下调MCM3的表达量，诱导两种癌细胞发生凋亡^[24]。在真核细胞中，CDC45对DNA复制起始和延伸发挥重要作用，参与细胞的表达调控。CDC45-MCM（2-7）-GINS复合物（CMG）构成真核复制体的核心，我们发现，尽管CDC45和GINS不能单独刺激MCM的活性，但是形成完整的CMG复合物可以有效地增加MCM的基础解旋酶活性^[25]。鱼藤素通过下调CDC45，从而达到诱导凋亡、抑制增殖的作用。因此，下一步的研究方向可能是：设计体内试验，建立小鼠肺癌、乳腺癌模型，用鱼藤素进行干预，观察模型小鼠的生理状态并探究鱼藤素的体内抗肿瘤效果，且进一步研究其对MCM3-CDC45蛋白表达量的影响。