单肺通气(OLV)是目前临床广泛运用的一种机械通气模式，但它会引起肺损伤^[1-4]。由于通过阻断疾病的早期关键病理环节以达到治疗目的，是难度系数最低、康复效果最理想的方法。所以，从肺微血管内皮细胞(PMVEC)通透性增加这一机械通气致肺损伤的早期关键病理变化环节^[4-5]入手，阐明其机制，找寻药物干预作用靶点，是临床防治OLV致肺损伤最科学的方法。

我们前期的动物实验研究发现，OLV可使实验动物肺内白三烯B4 (LTB4)大量生成^[6]；体外高通量基因芯片筛查发现，LTB4可使体外培养兔PMVEC磷脂酶Cεl(PLCE l)表达水平明显增高，细胞通透性增加。由于LTB4被认为是目前发现最为强效的炎症介质之一^[7]，并在机体众多的炎症性疾病中发挥重要作用^[8-11]。短暂的接触LTB4即可造成血管内皮细胞损伤以致血管通透性增加^[12]。据此我们提出科学假设：LTB4致OLV兔PMVEC通透性增加的机制与其上调PLCE1表达有关。

此外，由于LTB4是5-脂氧化酶代谢产物白三烯A4经由白三烯A4水解酶(LTA4H)直接代谢生成^[7]。但目前并不清楚OLV是否还可通过上调LTA4H表达使肺内LTB4生成增多。为此，本研究拟在OLV致兔肺损伤动物模型上，通过观察肺组织LTA4H表达变化，并探讨LTA4H抑制剂乌苯美司预处理减少肺内LTB4生成对肺组织PLCE1表达变化的影响，从LTB4的生成和作用途径进一步阐明LTB4致OLV兔PMVEC通透性增加的作用机制。

多功能麻醉机(Aestiva/5 7900，Datex Ohmeda. Inc)；麻醉监护仪(S/5 Compact，通用电器医疗集团)；多参数心电监护仪(M8003A，飞利浦公司)；酶标仪(Model NO 550，BIO RAD)；显微照相系统(DM4000B，LEICA)；48只健康日本大耳白兔，体质量2.2~2.5 kg，雌雄不拘，购自昆明医科大学实验动物中心。LTB4检测试剂盒(武汉优尔生，CEA562Ge)；PLCE1抗体(Biorbyt, orb335375)；LTA4H (santa cruz，sc-23070)和MLCK抗体((abcam，ab130135)；GAPDH抗体(abmart, M20006)；HRP抗山羊二抗(santa cruz，sc-2354)；乌苯美司(abmole，M1883)。本研究项目获云南省第一人民医院医学伦理委员会批准通过(2015LH026)。

实验动物随机均分为：对照组(C组)、生理盐水预处理组(S组)、(乌苯美司+生理盐水)预处理组(B组)、单肺通气组(O组)、生理盐水预处理+单肺通气组(SO组)和(乌苯美司+生理盐水)预处理+单肺通气组(BO组)。

参照Chen等^[13]和我们之前预实验的方法，将乌苯美司以2 mg/mL的浓度溶于生理盐水中，用橡胶导管法对B组和BO组进行每天1次的乌苯美司溶液(4 mL/kg)灌胃操作。S组和SO组以4 mL/kg的生理盐水灌胃。以上4组均持续灌胃5天。C组和O组不行灌胃处理。

麻醉诱导，单肺通气和术中监测的方法同我们之前研究^[6]，以恒速输注丙泊酚(0.6 mg·kg^-1·min^-1)和瑞芬太尼(1 μg·kg^-1·min^-1)，每30 min追加维库溴铵0.1 mg·kg^-1维持麻醉。

靠右肺上叶内1/2外侧缘处切取重约2~3 g肺组织，记录湿重(W)之后将标本置于干燥箱内(80 ℃，72 h)，充分干燥至恒重后再次称重(D)，计算W/D比值。

右肺下叶支气管-肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白浓度与血清总蛋白浓度之比为肺通透性指数。血清及BALF中的总蛋白测定采用二喹啉甲酸(BCA)法。

肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的激活被认为是反映PMVEC通透性增加的分子标志物^[14]。因此本研究运用Western blot和定量PCR分别检测右肺中间两叶MLCK蛋白和mRNA表达水平反映PMVEC通透性增加情况，具体方法见1.2.7。

靠右肺上叶外1/2内侧缘处切取肺组织，行HE染色。切片由一不知情的病理学专业技术人员参照之前^{[6, 15]}的方法在光学显微镜下对肺组织进行形态学评分。

ELISA检测右肺上叶LTB4含量，具体方法按试剂盒说明书进行。

取右肺中间两叶，分别运用Western blot和Q-PCR检测实验动物肺组织MLCK、LTA4H和PLCE1蛋白及其mRNA表达水平。

取肺组织100 mg，加入1 mL组织裂解液，电动匀浆后BCA法测定蛋白浓度。各样本均恒上样量70 μg，60 V电压电泳30 min，90 V电压电泳40 min，100 V电压湿转法转膜2 h。TBST充分洗膜。室温封闭1 h，加入对应浓度的一抗(MLCK，1: 500；LTA4H，1:500；PLCE1，1:200；GAPDH，1:2000)，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入HRP标记二抗(1:2000)，室温孵育1 h。TBST漂洗PVDF膜4次，每次5 min。将配置好的HRP底物显色液滴加到PVDF膜上，采用化学发光仪(Bio-Rad)采集图片，所得图片用Image J软件分析灰度值。

取重约100 mg的肺组织，提取组织总RNA。各组等量RNA上样，SYBR Green Master Mix试剂盒(Kapa公司)进行Q-PCR实验。PCR反应引物见表 1。Q-PCR反应体系：上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，SYBR Green Mix 5 μL，无RNA酶的去离子水3 μL。反应条件：95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。用GAPDH为内参进行校正，以正常组(C组)为对照组，得到目的基因表达的(Ct)值，以2^-ΔΔCt计算各样品表达量的相对值。

表 1(Table 1)

表 1 基因名称及其引物序列 Table 1 Primers used to amplify LTA4H, PLCE1 and MLCK Gene Primers (5'-3') LTA4H-F ATACGATTCAGATGGTTAC LTA4H-R TCATTCTTCCTTGTTCAG PLCE1-F TAGGAGTGTAGAGTTGGA PLCE1-R TTGGTTGTCAGTGTATGT MLCK-F GTCATCTGCTACATCCTG MLCK-R TAACATTGGCTAAGGTCTC GAPDH-F AAAGGGTCATCATCTCTG GAPDH-R GCTGTTGTCATACTTCTC

表 1 基因名称及其引物序列 Table 1 Primers used to amplify LTA4H, PLCE1 and MLCK

所有数据为计量资料，以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

与C组相比，S组和B组实验动物PMVEC通透性评价指标[肺W/D比值(图A)，肺通透性指数(图B)和MLCK蛋白(图C1、C2)及mRNA表达水平(图D))无显著性差异，但O组和SO组实验动物PMVEC通透性评价指标均显著增高(P < 0.05)，且后二者间相比无显著性差异；BO组实验动物PMVEC通透性评价指标明显低于O组和SO组(P < 0.05，图 1)。

图 1(Figure 1)

图 1 各组动物肺微血管内皮细胞通透性评价指标 Figure 1 Lung W/D ratio (A), pulmonary permeability index (B), MLCK protein expression (C1 and C2), and MLCK mRNA (D) of the rabbits in different groups for evaluating PMVEC permeability. C: Control group; S: Saline pretreatment group; B: Bestatin plus saline preatreatment group; O: OLV group; SO: Saline pretreatment plus OLV group; BO: Bestatin plus saline pretreatment with OLV group. *P < 0.05 vs O group, #P < 0.05 vs SO group, △P < 0.05 vs BO group.

C组、S组和B组实验动物肺组织部分区域见毛细血管扩张充血、肺泡腔内少量炎症细胞外，无明显病理改变。O组与SO组动物肺组织可见大量出血、充血灶，肺泡腔内较多红细胞和炎症细胞浸润，肺泡壁明显充血、增厚和渗出。BO组上述肺组织病理学改变较O组和SO组明显减轻(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 各组动物肺组织HE染色 Figure 2 Lung histology in different groups (HE staining, original magnification: ×200). A: Group C; B: Group S; C: Group B; D: Group O; E: Group SO; F: Group BO.

与C组相比，S组实验动物肺组织LTA4H和PLCE1表达水平(蛋白及mRNA)无显著性差异，B组实验动物LTA4H表达水平明显下降(P < 0.05)，PLCE1表达水平无显著改变，但O组与SO组实验动物肺组织LTA4H和PLCE1表达水平均显著增加(P < 0.05)，且后二者间无显著性差异；与O组相比，BO组实验动物肺组织LTA4H表达水平明显下调(P < 0.05)，同时伴有PLCE1表达水平的显著降低(P < 0.05，图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 各组动物肺组织LTA4H和PLCE1蛋白及mRNA表达变化 Figure 3 Expressions of LTA4H and PLCE1 proteins (A1, A2 and B), LTA4H mRNA (C1) and PLCE1 mRNA (C2) in rabbit lung tissues in different groups. * vs O group P < 0.05. # vs SO group P < 0.05. △ vs BO group P < 0.05.

与C组相比，S组和B组实验动物肺内LTB4含量及肺组织学评分无显著性差异，但O组和SO组上述指标均均显著增高(P < 0.05)，且后二者间无显著性差异；与O组和SO组相比，BO组实验动物肺内LTB4的含量及肺组织学评分明显降低(P < 0.05，图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 各组动物肺组织学评分和肺内LTB4含量 Figure 4 Histological scores (A) and LTB4 content (B) in rabbit lungs in different groups. * vs O group P < 0.05. # vs SO group P < 0.05. △ vs BO group P < 0.05.

本研究发现，单纯给予乌苯美司未引起实验动物出现不良副作用，这与他人研究相同^{[13, 16]}。单肺通气实验动物肺组织LTA4H表达水平增高，肺内LTB4生成增多，同时伴有PMVEC通透性(肺W/D比值、肺通透性指数和MLCK表达水平)和肺组织学评分的明显增加；运用LTA4H抑制剂乌苯美司下调LTA4H表达后，实验动物肺内LTB4生成明显减少，PMVEC通透性下降、肺损伤明显减轻。由于LTB4具有强烈促血管通透性增加作用^{[12, 17]}，且是LTA4H的唯一直接代谢产物^[18]。这一研究结果提示，单肺通气可上调LTA4H表达使肺内LTB4生成增多继而引起PMVEC通透性增加和肺损伤。同时提示，LTA4H可作为抗单肺通气致PMVEC通透性增加的药物干预作用靶点。

研究还发现，单肺通气实验动物肺内LTB4生成增多的同时伴有肺组织PLCE1表达水平的显著增高和PMVEC通透性的明显增加。运用乌苯美司减少肺内LTB4生成后，单肺通气实验动物肺组织PLCE1表达水平明显下降，PMVEC通透性降低。这一研究结果提示，LTB4致单肺通气实验动物PMVEC通透性增加的机制与上调PLCE1表达有关。由于PLCE1可被受体酪氨酸激酶(如表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、血小板生长因子等)和G蛋白偶联受体激活^[19-21]，而LTB4的生物学活性作用主要通过G蛋白偶联受体超家族来实现^{[7, 22]}，在肝脏缺血再灌注损伤修复的研究中发现，LTB4与其1型受体结合后可上调表皮生长因子和血管内皮生长因子表达，引起巨噬细胞募集^[23]。据此推测LTB4上调OLV实验动物肺组织PLCE1表达的机制可能与其上调表皮生长因子和血管内皮生长因子表达和G蛋白偶联受体超家族有关。

除此之外，单肺通气实验动物肺组织PLCE1表达水平增高的同时伴有肺组织MLCK表达水平的明显增加；PLCE1表达水平降低时，MLCK表达水平也明显降低。由于PLCE1具有鸟嘌呤核苷酸交换因子的功能，可以使Ras家族GTP酶从无活性的Ras-GDP转变为有活性的Ras-GTP，从而激活其下游的信号调节通路^{[19, 24]}。Ras家族中，RhoA主要参与应力纤维的形成和黏着斑复合体的组装。活化的RhoA可激活MLCK，继而引起肌动蛋白-肌球蛋白收缩和横向细胞肌动蛋白束(应力纤维)形成，最终导致细胞收缩和内皮细胞屏障功能破坏^{[14, 25]}。这些研究结果提示，单肺通气可通过上调PLCE1表达水平继而引起PMVEC通透性增加，而PLCE1调控PMVEC通透性的机制可能与RhoA/ MLCK信号通路有关。

综上所述，我们首次证实了：(1)OLV可通过上调LTA4H表达使肺内LTB4大量生成，继而引起PMVEC通透性增加和肺损伤；(2)LTB4可通过激活PLCE1/ MLCK信号通路引起OLV实验动物PMVEC通透性增加。本研究的不足之处在于对实验动物实施的是潮气量为20 mL/kg的“伤害性”通气模式，在目前临床普遍采用“非伤害性”通气模式的大环境下，该研究结果对临床的实际指导意义有限。因此，有必要进一步深入探讨花生四烯酸代谢途径关键酶及代谢产物在“非伤害性”通气模式中的作用。除此之外，对于LTB4调控PLCE1以及PLCE1调控MLCK信号通路的具体作用机制，均有待于进一步的深入阐明。