2017, Vol. 37
2. 安徽省感染与免疫重点实验室(蚌埠医学院);
3. 蚌埠医学院科研中心，安徽 蚌埠 233030;
4. 解放军123医院传染科，安徽 蚌埠 233010;
5. 蚌埠市传染病医院呼吸科，安徽 蚌埠 233010
2. Anhui Provincial Key Laboratory of Infection and Immunity;
3. Science Research Center, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China;
4. Department of Infectious Disease, 123 Hospital of PLA, Bengbu 233010, China;
5. Department of Respiratory Medicine, Bengbu Infection Hospital, Bengbu 233010, China
结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)是将Mtb无毒株H37Ra经121 ℃热处理后，从菌体胞浆释放到上清液中的一种多肽类抗原，研究证实该抗原可体外特异性激活和扩增人γδT细胞[1-2]。本实验室在前期研究中应用流式细胞术检测发现Mtb-HAg刺激下肺结核(PTB)患者外周血Mtb-HAg特异性γδT细胞中IFN-γ和TNF-α产生细胞比例显著低于结核潜伏感染者(LTBI)和健康者[3-4]而PTB患者和LTBI者外周血总T细胞中两种细胞因子的表达没有显著差异。Mtb-HAg-10k是从Mtb-HAg中提取的相对分子质量在10 000~14 000的小分子成分，在活化人γδT细胞中起主要作用，而Mtb-HAg中的大分子成分则主要激活αβT细胞[1, 5]。因此我们推测以Mtb-HAg-10k为刺激剂可能对外周血αβT细胞产生细胞因子的激活作用更弱，从而使IFN-γ和TNF-α更多的来源于γδT细胞。本研究以Mtb-HAg-10k为刺激剂，并以Mtb-HAg、多克隆刺激剂植物血凝素(PHA)作为对照，通过多色流式细胞技术比较刺激后外周血T细胞亚群IFN-γ和TNF-α产生细胞的数量和分布特点，酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测分析PTB患者和LTBI者外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γ产生细胞的数量差异，初步探讨Mtb-HAg-10k作为诊断抗原鉴别PTB和LTBI的可行性。
1 资料和方法 1.1 标本正常成人外周血采集自蚌埠医学院教职工和学生，年龄21~55岁，近期无感染性疾病史，体检胸部X线检查正常，并排除PTB、肿瘤、自身免疫病等疾病。16例正常人外周血经结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点试剂盒检测，从阳性检测结果筛选出LTBI者6例，其余10例作为健康对照(HC)。具体判断标准[3]：阳性：如阴性对照孔斑点数为0~5个，测试孔A和(或)测试孔B的斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6个。如阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔A和(或)测试孔B的斑点数必须≥2倍阴性对照斑点数。13例PTB患者外周血来自蚌埠市传染病医院呼吸科，年龄23~61岁，均符合中华医学会结核病学分会2001年《肺结核诊断和治疗指南》中肺结核病诊断标准，且无肿瘤、自身免疫病、艾滋病等其他合并疾病。每份标本均获得本人的知情同意，并且通过蚌埠医学院伦理委员会批准。
1.2 材料APC标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体(CD3-APC)及PE标记的小鼠IgG1同型抗体(mIgG1-PE)(Invitrogen)；APC vio770标记的小鼠抗人TCRγδ单克隆抗体(TCRγδ-APC vio770)、FITC标记的小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(IFN-γ-FITC)(Miltenyi Biotec)；莫能霉素(Monensin)、PE标记的小鼠抗人TNF-α(Biolegend)；FITC标记的小鼠IgG1同型抗体(mIgG1-FITC)(天津协科生物技术)；透膜缓冲液(eBioscience)；结核杆菌感染T细胞酶联免疫斑点诊断试剂盒(Human TB IFN-γ precoated ELISPOT kit)，产品编号：DKWTB-1002-096(strips)(深圳达科为)；PHA(Sigma)；淋巴细胞分离液(天津灏洋生物科技)；小牛血清(杭州四季青)；染色缓冲液(SB)、封闭液、固定液(2%多聚甲醛)均由本实验室自制。快速液相蛋白分离纯化系统(AKTA Explorer 100)(GE)；流式细胞仪(FACS Verse)(BD)；荧光酶联免疫斑点检测分析仪(S6)(CTL)。
1.3 Mtb-HAg-10k小分子多肽抗原的制备参照文献[6]，从本实验室培养的H37Ra无毒菌株中提取制备Mtb-HAg，将Mtb-HAg通过截留相对分子质量为30 000、10 000、3000超滤管进行离心超滤，收取Mtb-HAg低分子组分，即可通过10 000超滤管，但3000超滤管截留部分，离心收取的上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤并测定浓度，经快速蛋白液相色谱分析为含10 000~ 14 000 Mtb-HAg小分子多肽(Mtb-HAg-10k)，4 ℃保存备用。
1.4 分离人PBMC肝素钠抗凝全血与等体积RPMI 1640培养液混匀，缓慢叠加在淋巴细胞分离液上，2000 r/min，离心15 min。获取PBMC，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，1500 r/min，离心10 min后，弃去上清液。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度后备用。
1.5 流式细胞术检测Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例和细胞因子分布特点调整PBMCs浓度为(1~1.5)×106/mL，取500 μL/孔置于48孔培养板中，。按实验设计分为4组(3复孔/组)：1、阴性对照组：不加任何刺激剂；2、PHA刺激组：加入PHA(终浓度2.5 μg/mL)；3、Mtb-HAg刺激组：加入Mtb-HAg(终浓度10 μg/mL)；4、Mtb-HAg-10k刺激组：加入Mtb-HAg-10k(终浓度10 μg/mL)。各组细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养14 h后，加入高尔基体阻断剂Monensin(终浓度5 μmol/L)继续培养6 h以阻止细胞因子分泌到细胞外。培养结束后收集各组细胞，用SB洗涤2次后，弃上清每管加入500 μL SB重悬细胞，吸取100 μL细胞悬液(约1×105细胞)加入到流式管中，依次加入TCRγδ-APC vio770、CD3-APC进行表面分子染色，混匀后4 ℃避光反应30 min。每管洗涤1次后，加2%多聚甲醛200 μL固定30 min。，再洗涤1次，尽可能弃上清，加透膜缓冲液100 μL，同时加入3.5 μL封闭液(由小鼠血清和10%牛血清白蛋白按1:4混合而成)混匀避光30 min，在检测管内加入TNF-α-PE、IFN-γ-FITC作胞内染色，同型对照管中加入等量的同型对照抗体mIgG1-PE和mIgG1-FITC，4 ℃避光反应30 min。洗涤2次后弃上清，加2%多聚甲醛300 μL重悬细胞，应用流式细胞仪检测样本，检测数据用flowjo软件进行分析。
1.6 ELISPOT技术检测Mtb-HAg-10k特异性PBMCs中IFN-γ产生细胞数量调整PBMCs浓度为2.5×106/mL，取100 μL/孔加入ELISPOT检测试剂盒中的96孔板内，共计6孔。6孔分别为阴性对照孔：只加细胞培养液，不加任何刺激剂；阳性对照孔：加入PHA(终浓度2.5 μg/mL)；Mtb-HAg孔：加入Mtb-HAg(终浓度10 μg/mL)；Mtb-HAg-10k孔：加入Mtb-HAg-10k(终浓度10 μg/mL)；结核杆菌抗原A孔(加MTB特异性混合多肽A 10 μL)；结核杆菌抗原B孔(加MTB特异性混合多肽B 10 μL)。将细胞悬液置于5% CO2、37 ℃培养箱内培养20 h后，每孔加入4 ℃去离子水200 μL 10 min以裂解细胞；每孔加入200 μL洗涤液洗板5次，每孔加入100 μL生物素标记的抗人INF-γ抗体孵育1 h；洗板5次，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的酶联亲和物孵育1 h。洗板5次，每孔加入显色底物液100 μL，室温避光放置25 min。加入去离子水洗板2次中止显色。检测板放置在通风处自然晾干。荧光酶联免疫斑点检测分析仪(S6)进行斑点计数和数据分析。
1.7 统计学方法各实验组数据以均数±标准差表示，使用SPSS18.0软件进行处理，采用方差分析和q检验，P < 0.05具有统计学意义。
2 结果 2.1 Mtb-HAg-10k特异性诱导人外周血γδT细胞产生TNF-α和IFN-γ流式细胞术检测γδT细胞产生细胞因子TNF-α和IFN-γ水平，结果显示Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞中TNF-α产生细胞和IFN-γ产生细胞比例分别为(13.41± 3.01)%，(7.18 ± 1.77)%显著高于PHA对照组[(6.99 ± 3.23)%，(2.62±1.64)%，P < 0.01]；而Mtb-HAg-10k特异性αβT细胞中TNF-α产生细胞和IFN-γ产生细胞比例分别为(0.15±0.17)%，(0.06±0.04)%显著低于PHA对照组[(3.65±1.33)%，(0.61±0.28)%，P < 0.01]，Mtb-HAg-10k特异性αβT细胞中IFN-γ产生细胞比例(0.06±0.04)%显著低于Mtb-HAg刺激组[(0.14 ± 0.03)%，P < 0.01]，Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中TNF-α产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组、阴性对照组均无显著性差异(图 1、2)。
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图 1 不同刺激剂作用下外周血γδT和αβT细胞中TNF-α产生细胞比例 Figure 1 Proportion of TNF-α-producing cells in γδT and αβ T cells following different stimulations. |
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图 2 不同刺激剂作用下外周血γδT和αβT细胞中INF-γ产生细胞比例 Figure 2 Proportion of INF-γ-producing cells in γδT and αβT cells following different stimulations. |
Mtb-HAg-10k组和Mtb-HAg组在γδT细胞中TNF-α产生细胞的比例分别为(13.41±3.01)%，(15.86±4.15)%均显著高于IFN-γ产生细胞比例[(7.18±1.77)%，(9.18± 3.40)%，P < 0.01]；PHA组αβT细胞中产生TNF-α细胞比例(3.65 ± 1.33)%显著高于产生IFN-γ细胞比例[(0.61±0.28)%，P < 0.01]，而Mtb-HAg-10k组和Mtb-HAg组αβT细胞中TNF-α产生细胞比例(0.15 ± 0.17)%，(0.25 ± 0.14)%与同组IFN-γ产生细胞比例(0.06 ± 0.04)%，(0.14±0.03)%比较，均无显著性差异(P>0.05)。
2.3 Mtb-HAg-10k特异性γδT细胞产生细胞因子TNF-α和IFN-γ的分布特点在Mtb-HAg组、Mtb-HAg-10k组、PHA组中γδT细胞共表达TNF-α和IFN-γ的比例分别为：(8.05±3.09)%，(6.21±1.78)%，(1.93±1.42)%，三组IFN-γ+γδT细胞中同时表达TNF-α的细胞比例分别是：(85.82±6.43)%，(87.47±7.13)%，(69.64±16.58)%，Mtb-HAg-10k组、Mtb-HAg组显著高于PHA组(P < 0.05)，Mtb-HAg组与Mtb-HAg(10k)组之间的差异无统计学意义(P>0.05，图 3)。
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图 3 不同刺激剂作用下γδT中共表达TNF-α和INF-γ的细胞比例 Figure 3 Proportion of INF-γ-and TNF-α-producing cells in γδT cells following different stimulations. |
分别以Mtb-HAg-10k、Mtb-HAg、PHA为刺激剂作用于PBMCs 20 h后，应用ELISPOT技术检测PBMCs中IFN-γ产生细胞数量。结果显示，同一群体中MtbHAg-10k组IFN-γ产生细胞数均显著低于PHA刺激组(P < 0.01)和Mtb-HAg刺激组(P < 0.01)。Mtb-HAg-10k刺激下肺结核患者PBMCs中IFN-γ产生细胞数显著低于LTBI者(P < 0.01)和HC(P < 0.01)，而在Mtb-HAg组、PHA刺激组各人群间没有差异(P>0.05，表 1)。
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表 1 不同人群PBMCs中IFN-γ产生细胞数量 Table 1 Number of IFN-γ-producing cells in PBMCs from different subjects |
γδT细胞是表达TCRγδ的一类特殊T细胞亚群，约占人外周血T淋巴细胞总数的5%，它识别抗原没有MHC限制性，经嗜乳脂蛋白(BTN)3A1等分子递呈的磷酸类抗原刺激而被快速活化增殖[7-8]，可通过释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性物质直接杀伤靶细胞[9-10]，也可通过分泌细胞因子发挥免疫调节作用[11]，因此γδT细胞能较αβT细胞更早更迅速在感染性疾病免疫应答中发挥关键作用[12-13]。研究发现在抗结核感染免疫中TNF-α和INF-γ是两种关键细胞因子[14-15]，而γδT细胞是其重要来源细胞[16-17]。
目前体外活化扩增γδT细胞的刺激剂主要是磷酸类抗原[18]。本实验室及其他研究者证实Mtb-HAg也可使人外周血γδT细胞活化增殖[1, 19]。其作用方式可能是通过与TCRγδ直接结合诱导TCRγδ分子发生局部聚集化，导致功能性脂筏形成并促进Src蛋白激酶及其下游的信号分子快速活化从而激活γδT细胞[20]。其中刺激人γδT细胞增殖的活性成分主要存在于相对分子质量在10 000~14 000之间，非分泌性、对蛋白水解酶敏感的小分子多肽中[1, 21]，即Mtb-HAg-10k。本研究中我们通过流式细胞术检测发现Mtb-HAg-10k可优势诱导人γδT细胞产生TNF-α和INF-γ，这与我们前期关于Mtb-HAg的研究结果一致[4, 22]。进一步比较Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中IFN-γ产生细胞比例显著低于Mtb-HAg刺激组，Mtb-HAg-10k刺激下αβT细胞中TNF-α产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组、阴性对照组均无显著性差异，这提示着以Mtb-HAg-10k为刺激剂不但能象Mtb-HAg一样使γδT细胞优势产生IFN-γ和TNF-α，同时由于它不含有优势激活αβT细胞的Mtb-HAg大分子组分，从而使得Mtb-HAg-10k诱导的产生TNF-α和IFN-γ的T细胞更多的来源于γδT细胞。
本研究中我们通过流式细胞术检测分析发现Mtb-HAg-10k刺激组总T细胞中TNF-α和IFN-γ产生细胞比例与Mtb-HAg刺激组相比没有显著性差异，这可能与TNF-α和IFN-γ产生细胞在总T细胞中所占比例太少有关(0.40%~1.05%)。但通过ELISPOT技术检测结果显示Mtb-HAg-10k刺激下正常人群PBMCs中分泌IFN-γ细胞数量显著低于Mtb-HAg和PHA刺激组，这是由于ELISPOT比流式细胞术具有更高检测灵敏度(可达到1/104细胞)，使得Mtb-HAg-10k和Mtb-HAg刺激下的斑点形成细胞数量差异明显具有统计学意义。
近年来，IFN-γ释放试验已被广泛用于MTB感染的诊断，可用于评估人群中MTB感染率[23-24]。其中结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)就是应用ELISPOT技术检测经结核杆菌特异性抗原ESAT-6或CFP-10刺激后产生IFN-γ的效应性或记忆性αβT细胞数量的方法来判断受试者是否感染MTB，但无法有效区分PTB和LTBI。本研究中我们以Mtb-HAg-10k为刺激剂应用ELISPOT技术检测PTB患者PBMCs中IFN-γ分泌细胞数量显著低于LTBI和HC，这一现象可能与PTB患者γδT细胞在结核分枝杆菌的反复刺激下导致的细胞凋亡和功能异常有关[25]。
综上所述，我们的研究结果表明Mtb-HAg-10k可特异性诱导人外周血γδT细胞产生TNF-α和IFN-γ，应用ELISPOT技术检测Mtb-HAg-10k刺激下PTB患者IFN-γ产生细胞数量显著低于LTBI。这提示基于ELISPOT技术的Mtb-HAg-10k特异性IFN-γ释放试验可有助于区分PTB和LTBI。
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