白细胞介素-21（IL-21）是一种具有多样性免疫调节功能的细胞因子，其与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15同属于Ⅰ型细胞因子家族成员^[1]。IL-21主要由多种活化的CD4⁺T细胞分泌，包括Th17、NKT和Tfh等细胞亚群^[2-4]。既往在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠模型以及人类免疫缺陷病毒感染人群中的研究发现^[5-8]，病毒特异性CD4⁺T和CD8⁺T细胞功能出现部分耗竭，表现为IL-21分泌不足，而增加IL-21表达可提高病毒特异性CD8⁺T细胞应答能力，进而控制病毒复制，表明IL-21在慢性病毒感染中对病毒控制和疾病转归有着重要的影响。本课题组前期的研究结果表明^[9]，发生HBeAg血清学转换的非活动性携带期（IC）患者血清IL-21水平显著高于HBeAg阳性的免疫耐受期（IT）患者，提示血清IL-21表达上调可能是机体应对慢性感染和控制病毒过度复制的体现。另外，研究发现HBV DNA低水平的慢性乙型肝炎（CHB）患者其血清IL-21水平较病毒载量高水平患者升高^[10]。本课题组对两个独立队列的研究也发现CHB患者抗病毒治疗12周血清IL-21水平可以预测52周HBeAg血清学转换，提示IL-21可能通过调控多种免疫细胞参与了HBV清除和疾病转归^[9]。在慢性HBV感染中IL-21通过维持HBV特异性CD8⁺T细胞的功能抑制病毒复制^[10]。可见，在人慢性HBV感染中IL-21对病毒控制起了重要作用，并有望成为慢性HBV感染疾病免疫治疗的新靶点。近期体外研究发现外源性IL-21可增强HBV特异性CD8⁺T细胞的功能并促进其对HBV的控制，揭示了在慢性HBV感染疾病中IL-21具有一定的潜在治疗价值^[11-14]。然而，由于体外研究脱离了体内的微环境，其结果未能很好地外推到完整的机体中，且目前关于外源性IL-21在慢性HBV感染小鼠体内作用的研究尚未见报道，因此本研究我们将通过尾静脉注射绿色荧光蛋白（GFP）和小鼠IL-21双基因共表达的重组腺病毒（AdGFP-mIL-21）至HBV持续表达小鼠模型体内，观察IL-21对体内HBV相关抗原和抗体产生的作用，为IL-21在慢性HBV感染疾病中的治疗应用提供初步的理论依据。

野生型C57BL/6小鼠（6~8周龄，SPF级），购于南方医科大学实验动物中心。携带1.3拷贝HBV基因组（ayw亚型）的重组8型腺相关病毒（rAAV8-1.3HBV）采用尾静脉注射至野生型C57BL/6小鼠体内构建HBV持续表达小鼠模型^[15-16]，注射剂量为2×10¹⁰ vg/200 µL/只。每只小鼠在注射第0、1、2、3、4、6、8、10、12周进行眼眶后采血，收集血清样品用于HBsAg检测。根据第12周血清HBsAg定量水平将建模小鼠分为实验组和对照组，实验组给予尾静脉注射小鼠IL-21-GFP重组腺病毒（Ad-GFP-mIL21，1×10⁹ PFU/200 µL/只），对照组给予尾静脉注射空载GFP重组腺病毒（Ad-GFP，1×10⁹ PFU/200 µL/只）或PBS（200 µL/只），所有小鼠均在注射第1、4、7、10、13天眼眶后取血留取血清进行后续实验。实验动物的使用获得南方医科大学南方医院动物实验伦理会批准。

rAAV8-1.3HBV（批号：AMV-002 2016041201）购于北京五加和分子医学研究所有限公司，HBsAg（批号：B20150818）、HBsAb（批号：R20151211）和HBcAb（批号：KS20150101）检测试剂盒购于北京万泰生物药业股份有限公司，小鼠IL-21检测试剂盒（批号：4271535）购于eBioscience。

采用不同浓度（0、0.5×10⁷、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷、10×10⁷、20×10⁷ PFU）的Ad-GFP-mIL-21感染HepG2.2.15细胞，利用荧光显微镜观察重组腺病毒载体感染情况，并于感染后不同时间点（0、12、24、48、72 h）收集培养上清，采用ELISA检测mIL-21浓度；利用Western blot检测靶细胞内mIL-21的表达。

根据各试剂盒说明书采用酶联免疫试验（ELISA）方法进行检测，并根据相应的标准曲线换算后进行分析比较。

取实验组小鼠各器官组织采用OCT（批号：SAKURA 4583）包埋，置于-80 ℃保存，冰冻切片后滴加4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（批号：ZLI-9557）进行荧光染色。

所有数据采用Graphpad Prism 5.0进行处理和构图。计量资料采用中位数（四分位数间距）表示，两个或多个相关样本的比较分别采用Mann-Whitney U检验或Friedman M检验，配对样本不同处理的计量资料采用Wilcoxon符号秩检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

采用不同浓度的Ad-GFP-mIL21感染HepG2.2.15细胞，感染后24 h时HepG2.2.15细胞内即可见明亮绿色荧光，且随着感染病毒载体浓度的增加，可表达绿色荧光蛋白GFP的靶细胞数量增加（图 1A）。Western blot检测发现感染Ad-GFP-mIL21的HepG2.2.15细胞在相对分子质量约为18 000处可见阳性印记条带（即mIL-21），而感染空病毒载体的HepG2.2.15细胞在目的条带处未见任何信号（图 1B）。ELISA检测发现AdGFP-mIL21感染HepG2.2.15细胞后可产生mIL-21，且细胞培养上清中mIL-21的浓度随着病毒载体浓度和感染时间的延长而增加，呈现浓度时间依赖性；Ad-GFPmIL21（20×10⁷ PFU）感染HepG2.2.15细胞72 h后，上清中mIL-21浓度可高达813.9 pg/mL（图 1C）。

图 1(Figure 1)

图 1 Ad-GFP-mlL21感染HepG2.2.15细胞后检测上清和细胞mlL-21的表达 Figure 1 Expression of mlL-21 in culture supernatant and cytoplasm in HepG2.2.15 cells after infection by Ad-GFPmIL21. A: Observation under fluorescent microscope at 24 h after infection; B: Expression of mIL-21 in the cytoplasm after infection; C: Concentration of mIL-21 in the culture supernatant after infection.

通过尾静脉注射Ad-GFP-mIL21至HBV持续感染小鼠后观察其在体内的分布，结果发现仅肝细胞可表达绿色荧光蛋白GFP，而其他脏器组织，如肾脏、心脏、脑以及淋巴结等均未见绿色荧光表达（图 2A）；此外，AdGFP-mIL21予尾静脉注射后第4天，小鼠血清mIL-21水平较处理前显著升高（137.1 pg/mL vs 31.83 pg/mL，P＜0.05，图 2A），而注射Ad-GFP或PBS的小鼠血清mIL-21水平未见明显变化（图 2B）。

图 2(Figure 2)

图 2 Ad-GFP-mIL21在HBV持续感染小鼠体内各器官的表达以及血清mIL-21在各组的表达水平 Figure 2 GFP expression in different organs 4 days after injection of Ad-GFP-mIL-21 (A) and changes in serum levels of mIL-21 (B) after tail vein injection of Ad-GFP-mIL-21, Ad-GFP, or PBS in mice with persistent HBV infection.*P < 0.05, **P < 0.01.

ELISA检测发现注射rAAV8-1.3HBV至C57BL/6小鼠12周后血清HBsAg滴度为220.2 U/mL（216.2~262.4 U/mL），而予Ad-GFP-mIL21、Ad-GFP或PBS处理前小鼠血清HBsAg滴度分别为218.2 U/mL（150.7~262.1 U/mL）、228.3 U/mL（217.2~259.1 U/mL）、233.6U/mL（204.9~262.4 U/mL），组间差异无统计学意义。Ad-GFP尾静脉注射第4天小鼠血清HBsAg滴度为177 U/mL（119.9~224.9 U/mL），而予Ad-GFP-mIL21注射第4天小鼠血清HBsAg滴度为91.61 U/mL（26.03~157.9 U/mL），较处理前下降更明显（图 3A）。第13天时Ad-GFP-mIL-21注射小鼠血清HBsAg滴度较Ad-GFP处理小鼠显著下降[27.49 U/mL（9.938~38.04 U/mL）vs 102.3 U/mL（66.82~148.1 U/mL），P＜0.05]。各组小鼠在处理后第13天检测血清HBsAb均为阴性（图 3B），但Ad-GFP-mIL21处理小鼠其血清HBcAb水平较注射Ad-GFP或PBS的小鼠显著升高（图 3C）。

图 3(Figure 3)

图 3 小鼠血清HBsAg、HBsAb和HBcAb的表达水平 Figure 3 Serum levels of HBsAg (A), HBsAb (B), and HBcAb (C) in mice with persistent HBV infection after tail vein injection of Ad-GFP-mIL-21, Ad-GFP, and PBS.

IL-21是具有强大免疫调节功能的Ⅰ型细胞因子，可调控多种免疫细胞如B细胞、T细胞的功能，在慢性病毒感染疾病中对病毒控制发挥重要作用^{[5-7, 17-19]}。研究表明急性HBV感染患者血清IL-21的水平显著高于慢性HBV持续感染者^[20-21]，当慢性HBV感染者发生HBsAg血清学转换时其血清IL-21水平较未发生HBsAg血清学转换的患者升高^[22]，可见IL-21是影响慢性HBV感染转归的重要因素之一。Publicover等^[23]在HBV转基因小鼠模型中的研究发现，与幼年小鼠相比，成年受体小鼠肝内IL-21表达水平升高，能诱导有效的细胞免疫和体液免疫应答，肝内CD8⁺T细胞和B细胞数量增加且功能增强，最终导致HBsAg清除；当过继转移IL-21R缺陷小鼠的脾淋巴细胞后，成年受体小鼠则无法产生HBsAb，导致HBV抗原持续表达，表明在不同年龄阶段发生HBV感染时，体内IL-21水平与预后密切相关，此研究揭示了IL-21信号通路在控制慢性HBV感染中发挥了作用。虽然最近研究显示IL-21可在体外抑制HBV复制^[24]，然而在慢性HBV持续感染时，外源性给予IL-21能否在体内直接发挥抗病毒效应尚不明确。因此本研究我们借助HBV持续表达的成年小鼠，探讨外源性IL-21在慢性HBV感染时的作用。由于商品化的重组IL-21价格昂贵，且体内易于降解需多次注射，而重组腺病毒具有构建方便且可稳定表达外源性基因^[25]，因此本研究中我们选用Ad-GFP-mIL-21重组腺病毒进行研究。

本研究结果表明基于腺病毒载体构建的Ad-GFPmIL-21在体外可高效感染HepG2.2.15细胞并能产生mIL-21。Ad-GFP-mIL-21通过尾静脉注射到HBV持续表达小鼠模型后发现Ad-GFP-mIL-21腺病毒载体具有嗜肝性，此结果与Tomko等^[26-27]的研究一致。此外我们还发现其在体内感染肝细胞后可产生高浓度mIL-21并可显著降低小鼠血清HBsAg滴度。可见，Ad-GFPmIL-21不仅在体内外均可高效感染靶细胞，且其表达的mIL-21可显示生物学效应，具有应用的潜能。

与Publicover等^[24]的研究结果一致，本研究发现HBV持续感染小鼠给予IL-21重组腺病毒注射后其血清HBsAg表达水平逐渐降低，HBcAb滴度明显增加，这一结果表明IL-21可激发体内的体液免疫反应发挥清除病毒作用，且可促进HBV特异性抗体产生。然而，不同于Publicover等^[24]在HBV转基因小鼠中的研究结果，本研究中注射了IL-21重组腺病毒的小鼠其血清HBsAb水平仍然处于检测下限，考虑可能是由于小鼠模型不一致所致。本研究中的HBV持续表达小鼠模型通过rAAV8-1.3HBV体内转导法构建，该小鼠模型由于AAV8载体易于诱导免疫耐受导致HBV特异性的体液免疫反应未被充分激活^[15]，因此在外周血中无法检测到HBsAb。另外，我们考虑亦有可能是体内存在的HBsAg与HBsAb发生了中和反应，致使目前检测手段无法对HBsAb进行定量。此外，由于腺病毒空载体本身可诱导较强烈的天然免疫反应^[28-29]，给予小鼠注射空载重组腺病毒后亦可发现血清HBsAg水平有所降低。

综上所述，本研究结果显示mIL-21重组腺病毒能在体内成功表达mIL-21，且可降低血清HBsAg水平并促进HBcAb产生，表明此重组腺病毒能在慢性HBV小鼠模型中发挥控制病毒的作用，有望成为慢性HBV感染免疫治疗的手段，其在体内发挥作用的具体机制有待后续进一步研究。