循环肿瘤细胞（CTCs）主要指自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞能够脱离基底膜进入血液成为CTCs，少数CTCs能逃避机体的免疫杀伤而存活下来，部分肿瘤细胞团也可以直接从原发灶脱离并进入循环系统，形成循环肿瘤微栓（CTM）。这些CTCs和CTM随血液播散后可在其他部位形成新的转移灶，因而与肿瘤的转移和复发密切相关。

CTCs在外周血中十分稀少，大约为每10⁹ （10亿）个血细胞或每10^6~7个白细胞中存在1个CTC。但是，CTCs在形态和类别上仍有一定的异质性。在形态方面，CTCs可分为单细胞CTCs、细胞团CTM和血小板包裹的CTCs，也有部分CTCs是以与白细胞形成混合团块（WBC-CTC）^[1]的形式存在。在类别方面，CTCs可分为上皮细胞表型、间质细胞表型和混合表型。

CTCs的检测技术可分为富集和鉴定两步。CTCs的富集方法主要基于肿瘤细胞与血细胞的物理特性和生物特性差异进行分离。物理特性主要是利用CTCs体积大小、变形性、密度、电荷等性质的特点，利用滤膜^[2]、微流控^[3]、电化学^[4]等检测技术进行富集。生物特性富集主要是基于CTCs表达的特定蛋白和其侵袭能力进行分离^[5]，例如基于肿瘤相关抗原EpCAM的表达作免疫分选。其中CTCs的免疫分选方式可分为正性分选和负性分选，正性分选是利用肿瘤相关抗原的抗体，如抗EpCAM、抗HER2、抗EGFR等抗体对目标CTC进行捕获，负性分选是利用白细胞抗原（如CD45）去除白细胞。此外，还有许多新发展的基于纳米材料^[6]、适配体识别技术^[7]，基于声学原理的分离^[8]或肿瘤细胞端粒酶活性介导^[9]的分离体系，以及CTCs体内捕获技术^[10]等，这些方法有望在一定程度上提高检测的灵敏度和特异性。富集后细胞的鉴定方法主要有细胞形态结合荧光免疫细胞化学（ICC）方法、利用多重PCR检测肿瘤相关mRNA以及检测分析活肿瘤细胞特异分泌的蛋白质等方法^[11]。除了根据亚群特异的上皮型标志物EpCAM、E钙黏素、CKs等，间质型标志物N钙黏素、波形蛋白、ZEB1等进行CTCs的鉴定之外，还可以结合治疗相关、某些肿瘤特异的表面标志物同时对CTCs进行分析，例如CTCs表面表皮生长因子受体（EGFR）的检测^[12]。此外，Alix-Panabieres曾利用肿瘤细胞CK19、MUC1等蛋白质的分泌对肿瘤病人体内CTCs进行了检测鉴定^[13]。

由于CTCs的异质性，目前常用的富集和鉴定方法仍无法避免部分CTCs的漏检或错检。基于CTCs体积大小的物理特性相关富集方法会漏检一部分体积较小的CTCs亚群^[14]，基于CTCs表面上皮型标志物EpCAM的相关富集方法已被证实会漏检发生上皮间质转化（EMT）的CTCs亚群^[15]。针对这些问题，若同时结合多个标志物，主要是结合间质型细胞标志物如波形蛋白或其他一些肿瘤特异的分子标志物，或同时结合多种生物特性来富集CTCs，将会大幅提高CTCs检测的回收率和可靠性。CTCs的鉴定方法也各有优缺点。细胞形态与荧光ICC结合鉴定CTCs的方法若是使用传统的显微镜进行手工的观察和鉴定，较为费时费力，而改为使用一些可以自动扫描、自动识别阳性细胞并成像的设备可以很好的解决这一问题。利用多重PCR检测肿瘤相关mRNA鉴定CTCs的方法中RT-PCR的特异性和灵敏度还有待提高。因此，将不同的鉴定方法进行优化整合，可能可以更好的鉴定CTCs，获得更高的准确性。

此外，CTCs的数量与病人的临床分期和病情发展密切相关，或可利用CTCs的计数来检测肿瘤的药物敏感性^[16]。但目前更倾向于结合CTCs计数和下游分析来进行实验结果或肿瘤患者病情的综合判断。富集分离后可分别在蛋白质水平、RNA水平和DNA水平对CTCs细胞群进行分子分型和特征分析。例如，利用滤膜过滤细胞的方式富集CTCs后采用上皮型和间质型细胞标志物对应的RNA探针来检测两种CTCs的比例，可以获得CTCs上皮-间质分型的相关信息^[2]。此外，可以利用RT-PCR对CTCs表达谱^[17]进行分析，也可利用靶向PCR、DNA测序等对CTCs的突变^[18]、基因组等进行分析^[19]。同时，还可利用原位杂交的方法检测miRNA ^[20]的水平或比较分析不同CTCs的miRNA表达谱^[21]。利用单细胞全基因组测序^[22]、全外显子组测序^[23]、RNA测序^[24]或甲基化检测^[25]等技术来分析CTCs，可获得CTCs多组学生物信息，这也成为近几年CTCs研究的热点。但这些CTCs分析方法同时也存在一些问题，例如在对CTCs进行单细胞扩增与测序分析时，如何有效的分离单个活细胞，如何实现可用于测序分析的CTCs核酸提取，如何提高单细胞测序的深度和基因覆盖率，如何解读结果中可能存在的偏倚和假阳性问题等，都是CTCs单细胞测序分析的技术挑战。

CTCs的检测分析可用于肿瘤生物学以及致病机制等方面的基础研究，也可用于肿瘤病人或其他人群的病情和治疗的检测分析，从而指导临床诊疗实践。在肿瘤生物学研究方面，随着近年来单细胞分离和二代测序技术的发展，可以实现在单细胞水平上检测分析CTCs的基因组、转录组、甲基化组，获得相较于实体肿瘤不同，且更易获取的信息。CTCs异体移植模型的建立，可用于研究CTCs诸如转移潜能等方面的特性，从而对肿瘤的转移机制研究有一定的提示作用^[26]。检测分析CTCs也可能发现一些因肿瘤异质性而被传统的组织活检漏检的新突变^[27]，具有临床意义和基础研究价值。在临床应用方面，CTCs的检测分析可广泛用于健康状态、癌前病变、恶性肿瘤和肿瘤转移的人群。对CTCs数目或者分型、特性进行分析，有助于肿瘤的体外早期诊断、耐药性监测，判断预后及生存分析，检测肿瘤复发、评价药物疗效以辅助治疗决策及调整治疗方案。

血液中CTCs的定量可能可以实现对早期肿瘤病人的鉴别诊断。例如，CTCs的检测对于慢性阻塞性肺疾病病人发生肺癌的可能性具有指示作用^[28]。但由于检测方法的局限性，一些健康人群也可能出现CTCs假阳性的结果，因此CTCs在鉴别诊断方面的应用价值还有待考察^[29]。对于肿瘤的早期诊断，CTCs也可发挥重要的作用。尤其在一些致死率极高、进展较快的恶性肿瘤，如胰腺癌^[30]中，肿瘤的早期诊断具有重要的临床意义。Ankeny等^[31]通过研究发现CTCs有望成为胰腺癌的诊断和分期标志物。而在肺癌中，也已有研究者发现对于同一名肺癌病人，CTCs的出现比CT可检出病灶的出现早1~4年^[32]。除此之外，CTCs的检测分析也可用于肿瘤治疗疗效和复发的监测。例如，CTCs的数量和M型与E型CTCs的比例可以作为乳腺癌病人肿瘤治疗应答和疾病进展的标志物^[33]，且已有研究表明CTCs是早期乳腺癌微小转移的标志物^[34]，也是早期乳腺癌^[34]、晚期胃癌^[35]、结直肠癌^[36]等癌症的无病存活率和总生存率的独立预后因素。在ALK重排的非小细胞肺癌病人中，CTCs的ALK拷贝数变异可以在病人进行克唑替尼治疗时，预测其无进展生存期^[37]。不仅如此，检测肿瘤病人治疗前后CTCs水平的变化可以监测病人的治疗应答。已有研究表明，治疗前CTCs水平高的转移性乳腺癌病人在经过化疗后，其中CTCs水平转低的病人比CTCs持续增高的病人预后更好，且这一现象在治疗前CTCs水平较低的乳腺癌病人中也存在^[38]。而对于晚期结直肠癌病人，检测其化疗和靶向治疗前和治疗过程中CTCs水平可以独立预测病人的无病存活率和总生存率^[39]。此外，检测CTCs并扩展相关的体内或体外研究有助于开发新型抗癌药物，研究药物抵抗的作用机制^[40]，并有望指导临床用药。通过对非小细胞肺癌病人的CTCs进行基因分析，可以监测非小细胞肺癌病人对酪氨酸激酶抑制剂的耐药机制，从而指导临床病人用药^[41]。已有研究发现可在一些HER2阴性的乳腺癌病人的外周血中发现HER2阳性的CTCs，因此这部分病人也可以考虑使用如拉帕替尼等针对HER2位点的靶向药物进行治疗^[42]。由于CTCs来源于实体肿瘤，因此对CTCs的体外培养或体内模型的建立可能可以实现治疗方案的临床前测试^[43]，或获得病人对药物敏感性的个体化信息^[44]。但CTCs的体外培养还存在着许多技术难题尚待研究者们进一步攻克。

总而言之，CTCs检测分析在肿瘤生物学研究和临床医疗实践中都表现出广泛的应用价值和发展前景。CTCs作为一种易于获得的检测标志物，可以提供丰富的临床、基因和生物学信息，正在迅速成为肿瘤监测中的重要工具。目前CTCs检测方法尚不完善，亟需发展更加灵敏、特异、快速、有效的检测体系。CTCs体内捕获分析新技术的发展有望通过增加分析血量提高CTCs检测的敏感性，而未来发展基于两种或多重不同原理联合检测分析的方法可能更有裨益。另外，CTCs单细胞测序分析已经越来越受到大家的关注，并且其在肿瘤转移相关通路^[24]以及肿瘤相关突变方面^[18]已经有了一些研究成果，有望发现新的治疗靶标，从而实现抗转移治疗的个体化。除此之外，对迅猛发展的多种CTCs检测方法建立统一的评价标准和严格的标准化质量控制系统，有助于实现不同方法之间的比较分析，从而对分析结果进行更为全面、准确的解读，获得真正有益的疾病信息，并促进CTCs分析在临床诊疗中的推广应用和个体化医疗的发展进程。