原发性开角型青光眼（POAG）以眼压升高、视神经损害、视野缺损为主要临床表现，其发病机制尚未完全明确。POAG眼压升高主要是由于房水经小梁网（-TM）外流阻力的增加造成^[1]。透射电镜下可见POAG患者的TM细胞脱落溶解，细胞膜不完整，细胞核肿胀或皱缩，线粒体水肿，基底膜增厚，弹性纤维增多且排列紊乱^[2]。可见，TM是POAG的主要成因，亦可成为治疗的靶点。

TM位于巩膜静脉窦内侧，交叉成网格状，由小梁和小梁间隙构成，是房水循环进入巩膜静脉窦的必由之路。关于其组织结构，国内、外教科书一致认为，小梁为胶原纤维，小梁间隙表面覆以内皮^[3]。早期对TM结构的大量研究中同样认为TM主要由胶原纤维和内皮细胞构成，如邹欢^[4]研究显示TM是一种类海绵状板层结构，由多孔扁平的胶原纤维构成，眼压波动TM会发生一定形态结构变化；近年来，Koudouna等^[5]认为TM的细胞片层是由胶原纤维和少量小梁内皮细胞组成，其间所充斥的细胞外基质分子包括，弹性蛋白、胶原蛋白和一些高密度电子的黑色颗粒物质。在仔细观察眼球壁切片时，我们发现，TM显色与巩膜胶原纤维有明显差异，而与睫状肌一致且连续。有研究表明TM细胞具有收缩活动以及机械压力^[6-7]，并且这种收缩活动与房水流动及眼内压密切相关^[8]；TM具有不均一的α-SMA强阳性显色^[9]。万尚韬等^[10]研究发现TM处CD31、CD34阴性显色，同时α-SMA阴性显色。

由于现有研究对TM结构描述存在争议，观察切片后我们对TM是否由胶原纤维和内皮细胞构成也产生疑问，并且猜测TM内可能存在平滑肌纤维。为证明该猜想，我们采用不同的染色法对此进行了初步的探索。

取自南方医科大学实验动物中心健康成年家兔、SD大鼠和小鼠各3只。

整个实验采用多种染色方法验证TM组织结构，摘取眼球^[11]、切片后随机将切片分为5组，进行以下染色：HE染色、VG染色、Masson染色以及免疫组化染色。其中VG染色是针对胶原纤维最主要的特异性染色方法；Masson染色可以同时观察并区分平滑肌细胞、胶原纤维和内皮细胞；又分别采用α-SMA、CD31两种特异性抗体鉴别平滑肌与内皮细胞^[12-13]。

动物处死后立即摘取眼球，并迅速放入固定液中固定24 h。常规梯度脱水、浸腊、包埋。标本用轮转切片机进行切片，厚度4 μm，每种动物标本切片10片。

切片脱蜡至水，置Harris苏木精中染色，1%盐酸乙醇中分化，流水冲洗返蓝，置伊红染液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜观察摄片。

切片脱蜡至水，置Weigert氏铁苏木精染色（A、B液1:1混合，使用前混合），充分水洗，用Van Gieson氏溶液染色，快速水洗，吹干，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光学显微镜观察摄片。

切片脱蜡至水，置丽春红酸性复红染液染色，以1%磷钼酸水溶液分化处理，不水洗，直接用2%亮绿染液染色，快速水洗，电吹风吹干，中性树胶封固，光学显微镜观察摄片。

切片脱蜡至水，双氧水室温下处理，消除内源性过氧化酶活性，清洗后进行抗原修复，吸去封闭液加入第一抗体，4 ℃冰箱过夜，清洗后加入第二抗体温育，DAB显色，苏木素复染封片。阴性对照除不加入第一抗体外，其余步骤同上。阳性对照选择实验组眼球内睫状肌。一抗（1:200稀释，小鼠抗）和二抗均购自博士德（羊抗）。

切片脱蜡至水，双氧水室温下处理，消除内源性过氧化酶活性，清洗后进行抗原修复，吸去封闭液加入第一抗体，4 ℃冰箱过夜，清洗后加入第二抗体温育，DAB显色，苏木素复染封片。阴性对照除不加入第一抗体外，其余步骤同上。阳性对照选择实验组眼球内血管内皮细胞。一抗购自Abcam（ab28364，1: 50稀释，兔抗）；二抗购自博士德（羊抗）。

3种动物TM呈紫红色粗丝状结构，交织成网，与睫状肌纤维胞质染色高度一致；TM表面附着的细胞界限不清，核扁，细长，呈深紫色，其胞质与TM无明显界限。睫状肌为典型的平滑肌，按不同方向成束排列。纵切的细胞呈扁平状，胞质紫红色，核扁，细长。巩膜内胶原纤维呈红色，深染；成纤维细胞依附胶原纤维，长轴与胶原纤维长轴一致，轮廓不清，核细长呈线样，深紫蓝色。血管内皮细胞胞质呈淡紫色，核深染，由于切面原因形状不一，突于腔内（图 1），TM类似睫状肌，而与胶原纤维差异明显，网格中核类似平滑肌核。

图 1(Figure 1)

图 1 家兔眼球壁示TM H.E.染色 Figure 1 HE staining of the TM in rabbit eyeball (Original magnification: × 40). TM of all the three species stains purplish red, which is highly consistent with ciliary muscle fibers.

TM呈现淡红色，细丝状，而胶原纤维呈亮红色（图 2），TM内胶原蛋白阳性。

图 2(Figure 2)

图 2 家兔眼球壁示TM VG染色 Figure 2 VG staining of the TM in rabbit eyeball (× 20). TM stains reddish and the collagen fibers bright red.

TM呈红绿相间状，以红色结构为主，巩膜胶原纤维呈绿色波浪状，睫状体的平滑肌纤维呈紫红色（图 3A），血管内皮细胞呈绿色扁平状（图 3B），TM内存在较多的平滑肌纤维，亦可见胶原纤维。

图 3(Figure 3)

图 3 家兔眼球壁示TM Masson染色 Figure 3 Masson staining of the TM in rabbit eyeball. A: TM stains dark red with an extremely thin greenish tissue surrounding the red fibers (×40); B: Endothelial cells are green and flat (×20).

TM部分呈强阳性反应，胞质呈棕黄色颗粒（图 4A）。巩膜内胶原纤维及血管内皮细胞呈阴性，睫状体内的平滑肌纤维呈强阳性。阴性对照不着色（图 4B），TM内存在平滑肌纤维。

图 4(Figure 4)

图 4 家兔眼球壁示TM α-sm IHC Figure 4 IHC for α-sm in the TM in rabbit eyeball. A: Part of TM along with the ciliary smooth muscle fibers shows strong positive reaction with brown granules in the cytoplasm (×40); B: The scleral collagen fibers and vascular endothelial cells are negative (×20).

3种动物染色结果虽略有差异，但均为阴性（图 5A），且血管内皮细胞呈阳性反应（图 5B），阴性对照不着色（图 5C），TM内不存在血管内皮细胞。

图 5(Figure 5)

图 5 鼠眼球壁CD31 IHC Figure 5 IHC for CD31 in the TM in rabbit eyeball. A: TM from all the animals show negative reaction (× 40); B: Endothelial cells show positive reaction (× 40); C: Negative control (×20).

TM主要由与睫状肌延续而来的平滑肌纤维组成，其间有少量细丝状的胶原纤维；无内皮细胞。3种实验动物TM结构完整，且在五种染色中显色一致，说明其结构有生物共性。

在常规HE染色切片上我们发现，TM染色与睫状肌内的平滑肌纤维相似，似乎TM由平滑肌细胞组成。而且，TM似乎由睫状肌延续而来。进一步地，我们通过α-SM免疫组化和Masson染色证实：TM中存在较多的平滑肌纤维，其染色与睫状肌一致且连续。为了排除TM由胶原纤维组成，我们进行了胶原蛋白特异性的VG染色和Masson染色，结果仅在TM表面发现少量胶原纤维。我们推测，这极有可能为平滑肌纤维的肌内膜。为了证明TM小梁间隙表面不存在内皮细胞，我们用血管内皮细胞的特异性抗原CD31进行免疫组化染色，结果均为阴性，从而证实TM内根本不存在内皮细胞。实际上，之前已经有实验证明，人、猪、狗、牛眼球TM中内皮细胞特异性的凝血因子Ⅷ，CD31和CD34免疫组化阴性表达^[14-15]，与我们实验结果一致。但这些文献中均未给出合理的解释，也没有否认TM中内皮细胞的存在。

综上所述，通过多种组织切片，我们可初步断定TM主要由睫状肌延续而来的平滑肌纤维构成，外周包绕微量胶原纤维即肌内膜，不存在内皮细胞。该现象在家兔、大鼠和小鼠无差异，具有普遍性。就现有文献显示，透射电镜下可明显观察到小梁网组织有明暗交替的周期性横纹，作者认为其为肌内膜的Ⅵ型胶原原纤维^[5]。后续可通过电镜术或/和其他分子标记术甚至功能学进行深入研究。

众所周知，TM是房水循环的关键部位，而当房水外流受阻时，房水聚积在眼内，引起眼压升高，这是青光眼性视神经损害的主要危险因素^[16]。目前POAG的主要治疗手段是通过减少房水生成而降低眼压，但是TM营养物质及氧主要由流经TM的房水提供。Kiland ^[17]等实验证实，在减少房水生成一段时期后可减少房水外流。从而使提供给TM的氧及营养物质减少，并引起TM处细胞外基质积聚，使病情加重。手术游离TM的效果可能更糟。

当然，这些治疗是建立在“TM由胶原纤维构成”这一基础上的。如果TM为平滑肌呢？实际上，已经有研究证明，TM可被胆碱能药物等多种物质诱导在组织水平上表现出收缩效应^[18]。利用特异性的M₃受体单克隆抗体，可从原位证实人眼TM细胞表达M₃受体^[19]。而M₃受体主要分布于平滑肌和腺体中^[20]，介导平滑肌收缩和腺体分泌。这些实验都可辅助证明TM内存在平滑肌纤维。且近年来的研究表明，TM存在平滑肌样的α-肌动蛋白并具有主动收缩功能^[21]。

因此，未来青光眼的降眼压治疗应更注重增加TM途径的房水外流，而不是单纯地抑制房水生成，或许TM内的平滑肌纤维可以为治疗POAG提供新的靶点。