甲基苯丙胺（METH）属于苯丙胺类神经兴奋剂，在世界范围内被广泛滥用，是当前对公共卫生和社会危害最大的毒品之一^[1-2]。研究表明METH主要作用于中枢神经系统，结构与儿茶酚胺类神经递质相似，主要表现为多巴胺等单胺类神经末梢的损伤，可出现与帕金森病等神经退行性疾病相似的病理改变^[3-4]。近年来研究证实，多种机制参与了METH的神经毒性，主要包括氧化应激^[5]、神经元凋亡与自噬^[6-7]、兴奋性毒性^[8]、线粒体功能障碍^[9]等，其中氧化应激是METH所致神经毒性损伤的重要作用机制之一^[10]。二硫键异构酶（PDI）是一种内质网滞留蛋白，在稳定蛋白质的三维结构中起着重要作用，同时还具有分子伴侣活性，能抑制错误折叠蛋白的聚集^[11]。在神经退行性疾病的研究中发现，PDI可通过抑制错误折叠蛋白的聚集而起到保护神经元的作用。但PDI易与氧化应激产生的过量的NO结合，形成S亚硝基化PDI（PDI-SNO），导致其构象改变和功能障碍^[12]。α-突触核蛋白（α-SN）既参与正常突触功能的维持，又与帕金森病等神经退行性疾病有关，在生理状态下处于无序伸展状态，没有细胞毒性，而在病理状态下，可引起α-SN错误折叠，在细胞内聚集形成纤维化或寡聚体^[13-14]。研究认为聚集状态的α-SN能促进细胞的氧化应激增强，对神经元产生毒性作用，同时氧化应激又促进α-SN发生聚集，形成恶性循环^[15]。前期体内外研究发现，METH可以导致NO水平明显升高，氧化应激显著增强^[16-17]。PC12细胞在METH处理后，PDI发生S亚硝基化，α-SN表达明显升高并产生神经毒性^[18]，而关于METH对小鼠大脑的神经退行性病变的作用及其机制，尤其是PDI亚硝基化对METH致小鼠相关脑区α-SN表达的影响，未见相关报道。

基于此，本研究拟建立METH亚急性中毒小鼠模型，METH与一氧化氮合酶（NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）共同处理小鼠，检测NOS、NO、PDI、PDISNO和α-SN等指标，研究在METH致神经毒性中PDISNO对异常表达的α-SN的影响，进一步完善METH诱导的α-SN聚集的毒性机制，为治疗METH引起的神经毒性损伤提供理论基础。

C57 BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心，盐酸甲基苯丙胺购自中国药品生物制品鉴定所，N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）购自Sigma，兔抗鼠α-SN多克隆抗体购自CST，Cat no.#2642，兔抗鼠PDI多克隆抗体购自CST，Cat no. #2446，羊抗兔IgG-HRP购自北京锐抗公司，NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为国产分析纯。

取6周龄雄性C57小鼠40只，分笼饲养于22 ℃恒温动物房内，自由进水进食，建立12 h黑夜和白昼的交替循环，让小鼠适应环境1周后随机分成4组（n=10只/组），对照（CON）组、L-NNA组、METH组和METH+L-NNA组。L-NNA组和METH组给予单次腹腔注射L-NNA（8 mg/kg）或METH（15 mg/kg），间隔12 h注射1次，共8次。METH+L-NNA组腹腔注射L-NNA 8 mg/kg，0.5 h后给予METH 15 mg/kg。对照组小鼠同等条件下腹腔注射生理盐水300 μL/只。最后1次给药24 h后麻醉、断颈、分离纹状体和海马脑区。

Western Blotting法检测各组内NOS、PDI、α-SN等指标，生物素转化法对各组PDI-SNO进行转化后进行Western Blotting。NO含量用NO检验试剂盒检测。

采用GraphPad Prism software Version 5.0a（GraphPad Software Inc., 美国）软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

Western blotting检测纹状体和海马脑区内NOS表达情况，结果显示，METH组NOS表达较CON组显著增高（P < 0.05），且纹状体L-NNA组NOS表达较CON组明显降低（P < 0.05）；而当L-NNA与METH共同处理C57小鼠时，L-NNA可显著降低METH诱导的NOS的上升（P < 0.05，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 小鼠脑区各组NOS表达变化 Figure 1 Changes of NOS protein expression in the mouse brain in different groups. A, C: Western blotting for detecting NOS in the striatum and hippocampus, respectively; B, D: Gray values of NOS determined by Image J software. Data represent average from 3 independent tests. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs METH group.

NO检验试剂盒检测纹状体和海马脑区NO含量，结果表明，METH组NO含量较CON组显著增多（P < 0.05）；L-NNA组NO含量与CON组相比无明显差异（P > 0.05）；当L-NNA与METH共同处理C57小鼠时，L-NNA可显著降低METH诱导的NO含量的上升（P < 0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 小鼠脑区各组NO含量变化 Figure 2 Changes of NO level in the striatum (A) and hippocampus (B) of the mice in different groups. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs METH group.

采用生物素转化法将纹状体和海马脑区内PDISNO标记并转化，再利用Western blotting检测转化后PDI蛋白表达变化。结果表明，两脑区内METH组与CON组相比，可使PDI亚硝基化表达显著升高（P < 0.05）；L-NNA与METH共同处理组PDI-SNO含量较METH组明显降低（P < 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 小鼠脑区各组PDI-SNO表达变化 Figure 3 Changes of PDI-SNO level in the mouse brain in different groups. A, C: Western blotting for detecting PDISNO in the striatum and hippocampus regions, respectively; B, D: Gray values of PDI-SNO in the striatum and hippocampus determined by Image J software analysis, respectively. Data represent average from 3 independent tests. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs METH group.

Western blotting检测纹状体和海马脑区α-SN表达情况。结果表明，METH组α-SN含量均比CON组显著升高（P < 0.05），与前期的体外实验研究结果相一致；L-NNA组内α-SN含量与CON组无显著差异（P > 0.05），L-NNA与METH共处理C57小鼠，可有效抑制METH导致的α-SN的升高（P < 0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 小鼠脑区各组α-SN表达变化 Figure 4 Changes of α-SN level in the mouse brain in different groups. A, C: Western blotting for detecting α-SN in the striatum and hippocampus, respectively; B, D: Analysis of gray values of α-SN using Image J software. Data represent average from 3 independent tests. *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs METH group.

METH作为世界上滥用最广泛的苯丙胺类兴奋剂，具有药物依赖性、中枢兴奋性、致幻、食欲抑制等药理、毒理学特性^[19]。而由METH造成的神经退行性样改变^[20-22]一直以来是我们关注的热点问题。

研究表明，黑质区多巴胺能神经元的丧失与蛋白聚集体——路易小体的形成是PD的两大病理特征，α-SN是Lewy体的重要组成成分，错误折叠的α-SN的聚集被认为是帕金森病（PD）发病机制的关键环节^[23]。在METH致神经退行性样改变的研究过程中，METH作用后α-SN在纹状体、海马等脑区表达异常升高，并已证实α-SN在METH所致的氧化应激、多巴胺代谢障碍和线粒体功能丧失等神经毒性机制中起到关键作用。本研究前期使用METH处理分化的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞，结果发现PDI发生显著的S亚硝基化，L-NNA与METH共同处理细胞，可通过抑制NOS，减少细胞内NO的生成量，进而显著降低METH所致的PDI-SNO程度，缓解METH所致的α-SN的升高，从而改善METH所致神经毒性作用^{[18, 24-25]}。尽管我们前期研究发现METH所致的PDI-SNO对α-SN异常聚集有影响，但由于实验以PC12细胞系为模型，并不能真实反映METH作用后大脑神经元的毒性损伤变化，所以，为进一步阐明PDI-SNO在METH作用后对中枢神经系统内α-SN异常表达的影响，在体外研究基础上，本次实验利用小鼠METH亚急性中毒模型对神经毒性损伤明显的纹状体、海马脑区进行相关研究。并首次将NOS抑制剂LNNA应用于体内实验。结果发现，给予METH处理，在海马、纹状体区两个脑区，NO含量与PDI-SNO明显增加同时伴随α-SN表达升高；使用NOS抑制剂L-NNA与METH共处理C57小鼠，NO含量、PDI-SNO和α-SN表达均显著降低这表明L-NNA抑制NOS表达后，降低NO浓度从而减轻METH所致的神经毒性。这也间接证明了METH作用后NO含量升高，致使相关脑区氧化应激损伤^[26]，PDI发生显著S亚硝基化，导致α-SN表达升高^[27-29]。上述动物相关脑区的实验结果对我们前期的研究发现更有说服力。

结合我们的体内外研究，可以明确PDI是降解异常聚集α-SN的重要蛋白。METH作用后NO含量升高，引起氧化应激损伤，导致PDI发生S亚硝基化，使其功能丧失，错误折叠的α-SN降解障碍而发生异常聚集，最终产生神经毒性。此外，我们认为关键功能蛋白的硝基化也是METH神经毒性损伤作用的重要机制之一，以往研究报道METH可通过DDAH1/ADMA/NOS通路引起蛋白质硝基化水平升高导致神经毒性^[30-31]，关键蛋白如谷胱甘肽S-转移酶P1的硝基化可激活细胞周期素依赖蛋白激酶5导致氧化应激损伤，加剧细胞的死亡^[23]。由此，我们下一步将深入研究METH作用后氧化应激是否可以直接导致α-SN发生硝基化而影响其生物学功能，为阐明METH神经退行性病变的毒性机制奠定良好的基础。