由于铬（Ⅵ）及其化合物被广泛应用于工业制造，如电镀、制革、纺织染色、防腐和木材处理等^[1]，对环境造成了严重的污染，导致政府每年投入大量财政治理铬（Ⅵ）污染^[2]。微生物法具有独特的优势（成本低、经济、高效、环保）而被广泛研究^[3]。微生物除铬（Ⅵ）主要通过还原和抗性两大机制完成^[4]。其中对微生物铬（Ⅵ）抗性相关报道尽管已有20年研究，然而对于铬（Ⅵ）抗性相关基因及其表达蛋白的研究并不深入。普遍认为通过硫酸盐通道进入细菌胞内的铬（Ⅵ）是由质粒编码的膜转运蛋白ChrA泵出细胞外^[5]。早在19世纪已有研究者在Pseudomonas aeruginosa的质粒pUM505、Cupriavidus metallidurans的质粒pMOL28和其它质粒上发现了ChrA基因，但这些质粒上编码的ChrA基因只能在其野生宿主中发挥作用，而不能在大肠杆菌中异源表达^[6-8]。近几年逐渐在一些细菌基因组中也发现了铬（Ⅵ）抗性基因，如：E.coli KR29, Leucobacter salsicius type strain M1 -8T, Microbacterium sp, Cellulosimicrobium sp. KX710177 ^[9-13]。但是不同于其它金属抗性基因可以使微生物在一个较高的mmol浓度下生存，目前已知的铬（Ⅵ）抗性基因只能在亚mmol范围内提供保护^[14-17]。

为了寻求一个高效的铬（Ⅵ）抗性系统，本课题组对一株具有高抗铬（Ⅵ）性能的沙雷氏菌的遗传基因进行了研究。沙雷氏菌（Serratia sp.）S2是从长期Cr（Ⅵ）污染的某河水中分离筛选出能在较高浓度的铬酸盐中生存的菌株^[18]，全基因组测序发现其基因组中存在铬（Ⅵ）抗性基因ChrA，本文通过基因克隆和重组技术，确定了ChrA基因有助于提高菌株的抗铬性能，并进一步明确了ChrA蛋白转运铬（Ⅵ）的路径、动力和选择性等机制。为下一步构建具有高效除铬（Ⅵ）系统的工程菌提供了物种和基因资源，为利用具有高效抗铬系统的微生物治理铬污染提供了方向，奠定了理论基础。

质粒小提试剂盒，Universal DNA产物纯化试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒，2 ×Pfu PCR Master Mix酶，2×Taq Master Mix酶（天根生化科技（北京）公司）；DNA maker，EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ限制性内切酶，T₄ DNA连接酶，IPTG（宝生物工程大连有限公司）；氨苄青霉素，卡那霉素，LB培养基（生工生物工程（上海）有限公司）；抗His标签兔多克隆抗体和羊抗兔IgGHRP（北京博奥森生物技术有限公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（millipore，美国）其余均为国产或进口分析纯试剂。

E.coli BL21（DE3）感受态细胞、E.coli DH5α感受态细胞购自北京天根公司，克隆载体pMD19-T购买自宝生物公司，表达载体pET-28a（+）和沙雷氏菌CQMUS2由实验室-80 ℃保存。

提取步骤分别参照细菌水煮模板法^[19]和质粒小提试剂盒说明书操作。

从沙雷氏菌S2基因组序列文库中搜索到ChrA基因序列，利用软件Primer Premier 5设计引物：F1：5'-CCGGAATCCATGAGCAAAACGGTCGTTCT-3'，R1：5'-CCGCTCGAGTTCTGCGCCGGACAGT-3'，下划波浪线部分为保护性碱基，下划直线部分别为EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ的酶切位点，引物由上海生工合成。以提取的沙雷氏菌S2 DNA为模板，F1、R1分别为上下游引物，2×Pfu PCR Master Mix高保真酶扩增ChrA基因。PCR反应体系为25 μL，反应条件为：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；67 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30个循环；72 ℃，5 min。1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化片段，连接至pET-28a（+）载体，连接产物转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，随机挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并测序鉴定。

挑选测序正确的重组菌落接种于50 μg/mL的卡那霉素的LB培养液中，37 ℃培养至A₆₀₀为0.4~0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，30 ℃ 100 r/min培养8 h，同时诱导空载体作为空白对照。按照Triton x114去污剂法提取ChrA蛋白，BCA法测定蛋白浓度，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Western blotting鉴定。

上述诱导的去污相ChrA蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，洗涤后室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜，然后加入兔抗His-tag稀释液（一抗，1:400），4 ℃过夜孵育。TBST洗膜3次，每次10 min，加入羊抗兔IgG-HRP（二抗，1:9000），室温中平摇1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，将PVDF膜置于Bio-red荧光成像仪托板上，均匀滴加ECL发光液后进行曝光拍照。

分别将过夜培养的ChrA工程菌、沙雷氏菌S2和含有空质粒的E.coli BL21对照株按1:100的接种量分别接种于25、75、100、150和200 mg/L Cr₂O₇^2-的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min，培养18~24 h后测定培养基的A₆₀₀。每一处理设置3个平行样。

ChrA工程菌、沙雷氏菌S2和对照株过夜培养后1:100接种到新鲜LB液体培养基中培养至对数期，向培养基中加入25、50和100 mg/L的Cr₂O₇^2-离子，37 ℃振荡培养8 h，离心收集菌体，用微波消解法对菌体进行前处理，火焰原子吸收光度法测定胞内铬含量。提取菌体中ChrA蛋白（同1.2.3），以胞内铬含量与ChrA蛋白质的比值（µg/mg）表示菌株对铬（Ⅵ）的吸收能力，每一处理设同时做3个平行样。

ChrA工程菌、沙雷氏菌S2和对照株培养至对数期（同1.3.2），分别在50、75和20 mg/L Cr₂O₇^2-的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养30 min，使各菌胞内初始铬吸收量大约一致。收集菌体，用PBS缓冲液洗涤1次，重悬于等体积PBS缓冲溶液中，37 ℃振荡培养10~20 min。收集并处理菌体（同1.3.2），用石墨炉原子吸收光度法测定胞内铬含量。以胞内铬剩余百分比表示菌株对铬（Ⅵ）的外排能力，每一处理设置3个平行样。

工程菌培养和菌体处理同1.3.3，不同在于PBS洗涤1次后，重悬于各含氧阴离子（硫酸盐、钼酸盐、钒酸盐和钨酸盐）和抑制剂（NADH、缬氨霉素、寡霉素和氰根离子）的PBS缓冲溶液中。每一处理均做3个重复样，同时设置不加任何阴离子或抑制剂的PBS缓冲溶液为对照组。10 min后，测定胞内铬含量（同1.3.3）和蛋白质浓度（同1.3.2）。以胞内铬剩余百分比表示菌株对铬（Ⅵ）的外排能力，以处理组相对于对照组多出的铬含量百分比为抑制率。

应用SPSS17.0统计软件对所有计量资料进行t检验，统计结果以Mean±SD表示，P < 0.05为差异有统计学意义。

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示ChrA片段约为1400 bp（图 1），测序结果表明ChrA基因有1368 bp，编码455个氨基酸，蛋白相对分子质量约为50 000；将ChrA基因连接至pET-28a载体中，进行菌落PCR并测序鉴定，成功构建了pET-28a（+）-ChrA重组子（图 2）。

图 1(Figure 1)

图 1 ChrA基因琼脂糖凝胶电泳 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of ChrA gene. M: Marker; 1: ChrA.

图 2(Figure 2)

图 2 重组表达质粒pET-28a（+）-ChrA的PCR鉴定 Figure 2 PCR identification of the recombinant plasmid pET-28a(+)-ChrA. M: Marker; Lanes 1-4: pET-28a(+)-ChrA; Lane 5: ChrA.

用Triton x114去污剂法提取ChrA蛋白，SDSPAGE结果显示蛋白大多在去污相中，表明ChrA蛋白为疏水性膜蛋白，其大小约为45 000，而预测的ChrA蛋白50 000与pET-28a（+）载体上的His标签相对分子质量5000融合表达蛋白大小约为55 000，这可能是由于膜蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶上不寻常的迁移行为，造成预测的相对分子质量与SDS-PAGE胶上估计相对分子质量不一致；经Western blotting鉴定上述特异性条带为含His标签的目的蛋白（图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 重组大肠杆菌E.coli ChrA表达蛋白的SDSPAGE和Western blotting分析 Figure 3 SDS-PAGE and Westrn blot analysis of ChrA protein exprssion in the recombinant E.coli. M: Marker; 1-2: Decontamination phase, aqueous phase ChrA protein after induction; 3-4: Decontamination phase, aqueous phase ChrA protein before induction; 5-6: Decontamination phase, aqueous phase blank control after induction; 7-8: Western blot of decontamination phase ChrA protein after induction.

分别测定ChrA工程菌、沙雷氏菌S2和对照株在含不同浓度Cr₂O₇^2-的LB液体培养基中的抗铬（Ⅵ）能力。由图 4可知ChrA工程菌具有一定的铬（Ⅵ）的抗性能力，其最高能耐受200 mg/L的Cr₂O₇^2-。在100、150和200 mg/L Cr₂O₇^2-浓度下培养18~24 h后，A₆₀₀依次为沙雷氏菌S2 > ChrA工程菌 > 对照株（P < 0.05），即ChrA工程菌的抗铬（Ⅵ）生长能力显著低于野生株，但强于对照株。

图 4(Figure 4)

图 4 不同浓度Cr2O72-下菌株的铬（Ⅵ）抗性 Figure 4 Chromate resistance of Serratia.sp. CQMUS2 ChrA gene in E. coli BL21.

菌株含铬（Ⅵ）培养8 h后收集菌体测定胞内铬吸收量和ChrA蛋白比值（图 5）。结果表明，对铬的吸收能力依次为对照株 > ChrA工程菌 > 沙雷氏菌S2，即ChrA工程菌对铬（Ⅵ）的吸收能力较低，显著低于对照株，但高于野生株，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

图 5(Figure 5)

图 5 ChrA工程菌铬（Ⅵ）吸收 Figure 5 Chromate uptake by engineered E. coli BL21 ChrA strains.

含铬（Ⅵ）培养的菌株，置于无铬（Ⅵ）PBS缓冲液中，以胞内铬剩余百分比表示菌株对铬（Ⅵ）的外排能力。结果如图 6A所示，胞内铬剩余量多少依次为对照株 > ChrA工程菌 > 沙雷氏菌S2，差异具有统计学意义（P < 0.05）。

图 6(Figure 6)

图 6 ChrA工程菌的铬（Ⅵ）外排与铬（Ⅵ）负载时间对ChrA工程菌铬（Ⅵ）外排影响 Figure 6 Chromate efflux by E. coli BL21 ChrA strains (A) and effect of loading time on chromate efflux by cell suspensions of E. coli BL21 ChrA strains (B).

铬（Ⅵ）的外排在铬（Ⅵ）负载时间相对较短的情况下更加明显，工程菌在50 mg/L Cr₂O₇^2-培养基中负载30 min，重悬在PBS缓冲溶液中培养10 min后，铬（Ⅵ）外排量达到了22%。但随着细胞悬浮液在铬（Ⅵ）中孵育时间增长，铬（Ⅵ）外排量逐渐减少（图 6B）。

不同的阴离子对工程菌铬（Ⅵ）外排有不同的影响（表 1）。与对照组相比，硫酸盐和钼酸盐能显著性抑制工程菌中铬（Ⅵ）的外排（P < 0.05），而钨酸盐和钒酸盐对工程菌铬（Ⅵ）外排无明显抑制或促进作用。在含10 mmol的硫酸盐和钼酸盐的PBS缓冲液中孵育10 min，ChrA工程菌铬（Ⅵ）的外排抑制率分别达到了16.67%和17.95%。

表 1(Table 1)

表 1 含氧阴离子和抑制剂对ChrA工程菌铬外排能力的影响 Table 1 Effect of oxyanions and inhibitors on chromate efflux of ChrA engneered bacteria (Mean±SD) Treatment Intracellular Cr residue (%) Inhibition (%) P Oxyanions     10 mmol/L sulfate 91±0.58 16.67* 0.004     10 mmol/L molybdate 92±4.00 17.95* 0.013     10 mmol/L vanadate 78±4.73 0 0.617     10 mmol/L tungstate 74±2.65 (-5.13) 0.359 Inhibitors     10 μmol/L valinomycin 91±5.20 14.61* 0.016     10 mmol/L CN- 89±2.65 14.10* 0.006     1 μmo/L oligomycin 80±1.73 2.56 0.262     2 mmol/L NADH 56±1.73 (-28.21)* 0 Control group 78±2.00 - - *P < 0.05 vs Control group.

表 1 含氧阴离子和抑制剂对ChrA工程菌铬外排能力的影响 Table 1 Effect of oxyanions and inhibitors on chromate efflux of ChrA engneered bacteria (Mean±SD)

各类抑制剂对ChrA工程菌铬（Ⅵ）外排有不同影响（表 1）。NADH的存在对ChrA工程菌铬（Ⅵ）的外排有促进作用，差异具有统计学意义（P < 0.05），能使铬（Ⅵ）外排率提高约28%。K⁺离子载体缬氨霉素和呼吸链抑制剂CN-能显著抑制工程菌外排铬（Ⅵ），差异具有统计学意义（P < 0.05），外排率分别被抑制了14.61%和14.10%。而ATP代谢抑制剂寡霉素对铬（Ⅵ）的外排无明显促进或抑制作用，差异无统计学意义（P > 0.05）。

目前，国内仅何敏艳等^[20-21]研究了ChrA蛋白在细菌Bacillus cereus SJl和Lysinibacillusfusiformis ZCl中的功能，除此之外再没有人从分子和蛋白水平上研究微生物的Cr（Ⅵ）抗性，更没有相关工程菌的研究。国外研究最早的铬（Ⅵ）抗性基因是由Pseudomonas aeruginosa的质粒pUM505以及Cupriavidus metallidurans的质粒pMOL28编码的ChrA基因。但是研究发现这两个菌株表达的ChrA基因并不能在大肠杆菌中异源表达^[22-23]。

基于此，本研究首次从具有除铬（Ⅵ）能力的沙雷氏菌S2中克隆出ChrA基因，并进行重组表达。研究表明ChrA基因能在大肠杆菌中表达，赋予了菌株一定的抗铬（Ⅵ）能力，但ChrA工程菌的抗铬（Ⅵ）能力低于野生株，说明微生物对铬（Ⅵ）的抗性不仅仅是一个基因，一个蛋白的作用，而是多种基因成组型表达的结果。为了进一步明确ChrA基因的功能，本研究测定了工程菌铬（Ⅵ）的吸收能力，结果其吸收能力远小于对照株，说明ChrA基因的表达能降低菌株对铬（Ⅵ）的吸收。但一般来说工程菌铬（Ⅵ）吸收减少有两方面原因：（1）铬（Ⅵ）进入细菌体内的通道被堵塞；（2）细菌体内存在一个外排系统。为了区别这两种可能性，我们测定了菌株对铬（Ⅵ）的外排，结果工程菌外排能力高于对照株，且差异具有统计学意义，表明ChrA基因的表达加强了菌株对铬（Ⅵ）的外排。结合吸收和外排实验结果，可以认为工程菌铬（Ⅵ）吸收的减少是由于高效铬（Ⅵ）外排系统的存在，该结果也符合已报道文献中发现的ChrA功能^[24]，证明了ChrA蛋白参与铬（Ⅵ）的外排。

通过测定含铬（Ⅵ）培养时间、含氧阴离子和抑制剂对铬（Ⅵ）外排的影响，本课题组初步探索了ChrA工程菌铬（Ⅵ）外排的机制。随着含铬（Ⅵ）培养时间的增长，ChrA工程菌铬（Ⅵ）外排量逐渐减少，推测可能是铬（Ⅵ）还原成了铬（Ⅲ），在生理pH条件下，铬（Ⅲ）主要以不可溶的氧化物或者氢氧化物形式存在，导致其不能由ChrA蛋白排出细胞外^[25]，但由于实验条件有限不能进一步验证。另一种原因可能由于时间过长，铬（Ⅵ）与胞浆成分发生了结合。Broer等^[26]报道过在较长时间的放射性砷元素缓冲液中孵育后，表达砷抗性操纵子的菌株Staphylococcus aureus在无砷环境下培养一段时间，细胞内仍然有较高水平的砷元素，并且增加细胞通透性也不能除去放射性，由此推测砷元素和胞浆成分发生了结合。

在含氧阴离子中发现硫酸盐和钼酸盐能抑制铬（Ⅵ）的外排。大多研究认为铬（Ⅵ）是通过细胞硫酸根离子通道进入细胞，是硫酸盐的毒性模拟物，具有竞争性抑制硫酸盐运输的能力；钼酸盐亦是另一种硫酸盐转运竞争抑制剂^[27]。因此，推测ChrA蛋白可能与钼酸盐和硫酸盐结合从而抑制了铬（Ⅵ）的外排，但尚不清楚ChrA蛋白是否将钼酸盐和硫酸盐排出胞外使细胞具有相应的抗性能力；而其他含氧阴离子如钨酸盐和钒酸盐对铬（Ⅵ）外排无显著性抑制作用。以上结果表明铬（Ⅵ）是通过硫酸盐通道出入细胞，ChrA作为铬（Ⅵ）外排蛋白具有较高的特异性。

抑制剂中的NADH能显著促进ChrA工程菌对铬（Ⅵ）的外排，即ChrA蛋白介导的铬（Ⅵ）转运需要跨膜H+浓度梯度。而K+离子载体缬氨霉素和CN-能显著抑制工程菌外排铬（Ⅵ），表明细胞两侧的膜电位影响ChrA蛋白外排铬（Ⅵ）。综合以上结果说明ChrA蛋白外排铬（Ⅵ）是利用质子推动力通过细胞膜化学渗透作用把铬（Ⅵ）离子泵出细胞外。

本研究对沙雷氏菌S2中一个ChrA基因进行了克隆和表达，成功构建了ChrA工程菌，且工程菌对铬（Ⅵ）具备较强的抗性能力。为今后开展基因工程菌和铬（Ⅵ）抗性基因在铬（Ⅵ）污染土壤或水体中的实际运用奠定了基础，具有重要的开发价值。