髓样相关蛋白8(MRP8) 和髓样相关蛋白14 (MRP14)，又名S100A8和S100A9，属于S100钙结合蛋白家族成员^[1]。MRP8/MRP14生物学功能极其丰富，参与蛋白质磷酸化^[1]、细胞骨架重塑^[2]、细胞迁移^[3]、调节钙离子稳态^[4]、花生四烯酸代谢^[5]、对中性粒细胞NADPH氧化酶的调控^[6]等，其在炎症及其相关疾病中的作用最近才受到重视^[7]。MRP8和MRP14参与诸多炎症相关疾病的发生发展，包括脓毒症^[8-11]、肿瘤^[1]以及自身免疫相关性疾病等^{[1, 12]}。

MRP8/MRP14是新近鉴定的重要的内源性损伤相关模式分子(DAMPs)^[7-8]。正常情况下，MRP8/MRP14组成型表达于中性粒细胞与单核细胞，在中性粒细胞中含量丰富，约占可溶性胞浆成分的50%^[1]; 病理状态下，胞内MRP8/MRP14可通过坏死或活化细胞被动或主动释放到细胞外，作为重要的内源性DAMPs分子发挥免疫调节作用^[17]。MRP8/MRP14起始并扩大炎症反应的作用已得到普遍认识，MRP8/MRP14通过诱导炎性细胞因子的释放以及炎症相关细胞的迁移、粘附等介导机体的炎症反应^{[3, 13]}。目前有很多研究聚焦MRP8/ MRP14介导炎症反应的机制，研究表明MRP8/MRP14可通过促进促炎细胞因子的表达与释放，如TNF-α、IL-1b、IL-8等参与机体的炎症反应^{[1, 8, 14]}；MRP8/MRP14通过TLR4-TRIF-NF-kB/IRF3信号通路，诱导单核细胞IP-10的表达，进而介导CXCR3⁺林巴细胞的趋化，参与损伤介导的炎症反应^[15]。而关于MRP8/MRP14对原代腹腔巨噬细胞的作用及其机制，尤其是MAPKs家族成员在其中的重要作用，相关研究较少。

基于此，本研究拟利用原代分离的小鼠腹腔巨噬细胞，筛选MRP8/MRP14诱导小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子表达的情况，鉴定MRP蛋白诱导细胞因子表达的结构域，探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在其中的作用，同时对MRP8/MRP14的作用受体进行了初步筛选。本研究对深人认识MRP8/MRP14介导机体炎症反应的机制有着重要意义。

SPF级BALB/c小鼠，雄性，6~8周龄，购自南方医科大学实验动物中心，E.coli DE3感受态细胞由本实验室保存。

实验所需原核表达载体均由本室构建保存；DMEM培养基、胎牛血清(FBS, Gibco); 异丙基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG)、Ni²⁺-NTA-agarose(Merck); 小鼠细胞因子检测试剂盒(Millipore); 多粘菌素B (PMB)、各种信号通路抑制剂SB203580、SP600125、PD98059和U0126(Merck); 抗磷酸化或总的p38、JNK和ERK激酶抗体(CST); Toll样受体4 (TLR4) 抑制剂TAK242(APEXBIO)，晚期糖基化终产物受体(RAGE)中和性抗体(R & D)。

MRP8、MRP14蛋白以及MRP14各个结构域蛋白包括：His-EF-hand1-EGFP、His-EF-hand2-EGFP、His-CT-EGFP及His-EF-hand1 + 2-EGFP均采用原核蛋白表达系统，相关的质粒载体转化E.coli DE3感受态，IPTG诱导表达蛋白，用Ni²⁺-NTA-agarose纯化，蛋白经DPBS透析及0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。鲎试剂法(LAL)检测制备的重组蛋白内毒素含量低于0.25EU/mL。MRP8/MRP14异源二聚体的构建按照参考文献[5]方法进行，将MRP8与MRP14按等摩尔比混合，制成MRP8/MRP14异源二聚体重组蛋白。

8周C57BL/6小鼠乌拉坦(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，置于解剖板上，用针头固定四肢，腹部去皮，沿着腹白线偏左或偏右向腹腔注射无菌的PBS缓冲液5 mL，轻柔小鼠腹部2~3 min，用注射器抽取腹腔液，重复3次，吸取液1000 r/min离心5 min, 弃上清。细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，接种于96孔板或6孔板中，2 h后更换培养液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养过夜，次日用于实验研究。胎盘蓝染色鉴定细胞存活状况。

将分离的小鼠PMs按照1×10⁴/孔的密度铺于96孔板中，培养24 h后，更换为无血清培养液，使用1.5 mg/mL MRP8/MRP14蛋白刺激细胞24 h，收集细胞上清液，12 000 r/min离心10 min, 弃杂质。对照组加人单纯培养液; 重组蛋白预先与多粘菌素B(PMB，20 mg/L)室温孵育30 min，用以去除重组蛋白脂多糖(LPS)的污染。每实验分组设置3个平行孔，每个独立实验重复3次。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素诱导蛋白10 (IP-10)、白介素-2(IL-2)、IL-6、IL-5以及γ-干扰素(IFN-γ)细胞因子的表达采用Luminex xMAP液相芯片检测系统完成。具体操作步骤如下:首先取25 μL待测细胞培养上清液加人96孔过滤板中，加人25 μL偶联待检测目标抗体的球形基质(一抗)，漩涡混匀，室温避光振摇2 h。利用磁力架除去反应孔中的液体，之后加人150 μL洗涤缓冲液，轻轻振摇后，除去液体，每孔加人25 μL生物素化的二抗(报告分子)，室温避光振摇1.5 h; 每孔加人25 μL链霉亲和素偶联的藻红蛋白溶液，室温避光振摇0.5 h; 150 μL洗涤缓冲液洗涤2次，每孔加人150 μL检测缓冲液，室温避光振摇5 min; 最后在Luminex xMAP液相芯片检测系统上读取各孔荧光强度，并根据制作的标准曲线计算细胞因子浓度。

小鼠PMs按照1×10⁴/孔的密度铺于96孔板中，培养24 h后，更换培养液为无血清培养液，1.5 mg/mL重组的MRP14不同结构域融合蛋白(图 1) :MRP14-EGFP全长、EF-hand1-EGFP、EF-hand2-EGFP、CT-EGFP、EF-hand1+2-EGFP，以及单独EGFP蛋白刺激细胞，24 h收集培养上清，Luminex xMAP液相芯片系统检测TNF-α、IP-10和IL-6的表达。

图 1(Figure 1)

图 1 MRP14结构域示意图，EF-hand1，EF-hand2和CT末端结构域 Figure 1 Schematic diagram showing MRP14 protein structure, which contains EF-hand1, EF-hand2 and CT.

小鼠PMs按照5×10⁵/皿接种于60 mm细胞培养皿中，长至约90%融合。细胞用1.5 mg/mL MRP8/MRP14复合物刺激不同时间点：0、5、10、15、30、60和120 min。刺激结束后细胞用PBS洗涤1次，各加入150 μL细胞裂解液，冰上裂解20 min。利用细胞刮子刮取细胞裂解物，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。收集上清，每组取15 μL样品进行SDS-PAGE。蛋白用半干转移法转印至PVDF膜，膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，依次与1: 1000稀释的Ⅰ抗4 ℃孵育过夜，以及1: 2000稀释的HRP偶联的IgG室温孵育1 h后，利用KodakIS4000R图像工作站进行化学发光检测。

小鼠PMs按照1×10⁴/孔的密度铺于96孔板中，培养24 h后，更换培养液为无血清培养液，实验分为6组：对照组、MRP8/MRP14组、MRP8/MRP14 + SB203580（p38 MAPK抑制剂）组、MRP8/MRP14 + SP600125（JNK抑制剂）组、MRP8/ MRP14 + PD98059（MEK/ERK抑制剂）组、MRP8/ MRP14+U0126（MEK1/2抑制剂）组；细胞预先使用SB203580（20 mmol）、SP600125（20 mmol）、PD98059（30 mmol）和U0126（10 mmol）预处理1 h，之后用1.5 mg/mL MRP8/MRP14复合物刺激12 h，对照组加入单纯培养液，之后按照上述方法收集细胞上清，Luminex xMAP液相芯片系统检测TNF-α、IP-10和IL-6的表达。

小鼠PMs按照1×10⁴个/孔的密度铺于96孔板，培养12 h后加刺激。实验分为4组：对照组、MRP8/MRP14组、MRP8/MRP14+TAK242；MRP8/MRP14+RAGE中和性抗体。细胞预先使用TLR4受体抑制剂TAK242和RAGE neutralized Ab封闭1 h，之后用1.5 mg/mL MRP8/MRP14蛋白复合物刺激12 h，收集细胞上清，检测TNF-α、IP-10和IL-6的表达。

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据用均数±标准差表示。组间比较采用方差分析和t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。

1.5 mg/mL MRP8/MRP14蛋白复合物刺激腹腔巨噬细胞，24 h后收集细胞上清Luminex检测细胞因子表达，与对照组相比，MRP8/MRP14能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6的表达（P < 0.01），蛋白表达水平分别从对照组的3.03±0.68 pg/mL、3.92±0.78 pg/mL和1.2 ± 0.3 pg/mL升高至297.68 ± 13.67 pg/mL、1484.97±206.54 pg/mL和7.57±1.86 pg/mL，升高约98.2、378.6和6.3倍；MRP8/MRP14对IL-2、IL-5和IFN-g的诱导表达作用则不明显（P > 0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞细胞因子表达情况 Figure 2 Expression of cytokines induced by MRP8/MRP14 in peritoneal macrophages. **P < 0.01 vs control group.

MRP14全长及不同结构域融合蛋白刺激细胞，24 h后收集细胞上清，检测TNF-α、IP-10和IL-6的表达。与对照组相比，MRP14全长、EF hand-1、EF hand-2及EF hand-1+2结构域融合蛋白均能够诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达（P < 0.01），而CT末端结构域则不具有诱导活性（P > 0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 MRP14不同结构域EF-hand 1、EF-hand 2、CT和EF-hand1+2诱导腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6表达情况 Figure 3 Expression of TNF-α, IP-10 and IL-6 induced by different domains of MRP14, including MRP14 full length, EF-hand 1, EF-hand 2, CT and EF-hand1+2 in peritoneal macrophages. A: TNF-α; B: IP-10; C: IL-6. **P < 0.01 vs control group.

1.5 mg/mL MRP8/MRP14刺激细胞，不同时间点收集细胞裂解物，Western blot检测激酶磷酸化变化，MRP8/MRP14能够显著诱导p38 MAPK、JNK磷酸化变化（图 4A），MRP8/MRP14刺激细胞1 h后p38、JNK即发生明显磷酸化变化，持续至2 h，灰度值分析（图 4B）差异具有统计学意义（P < 0.01）；同时ERK激酶在MRP8/MRP14刺激早期10 min出现一个高峰，之后下降，在1 h再次发生磷酸化变化，持续至2 h，呈现“双峰”，差异具有统计学意义（P < 0.01）。

图 4(Figure 4)

图 4 MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞p38 MAPK、JNK和ERK激酶的磷酸化变化 Figure 4 Phosphorylation of p38 MAPK, JNK and ERK in peritoneal macrophages induced by MRP8/MRP14. A: Western blotting for detecting phosphorylation of p38 MAPK, JNK and ERK; B: Gray values of p-p38, p-JNK, p-ERK determined by ImageJ software analysis and normalized with the gray value of total-p38, total-JNK and total-ERK, respectively. Data represent average from 3 independent tests. **P < 0.01 vs 0 min group.

观察p38 MAPK、JNK和ERK激酶抑制剂对MRP8/MRP14诱导细胞因子表达的影响，与单纯MRP8/MRP14组相比，SB203580显著抑制了TNF-α（P < 0.01）、IP-10（P < 0.05）和IL-6（P < 0.05）的表达；SP600125显著抑制了TNF-α（P < 0.01）、IP-10（P < 0.05）的表达，对IL-6的表达则无影响（P > 0.05）；ERK及其上游MEK1/2的抑制剂PD98059和U0126显著抑制IL-6的表达（P < 0.05），对TNF-α的表达无影响（P > 0.05），有趣的是ERK抑制剂反而增强了IP-10的表达（P < 0.05，图 5）

图 5(Figure 5)

图 5 p38 MAPK、JNK和ERK激酶抑制剂对MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6表达的影响 Figure 5 Effect of SB203580 (p38 MAPK inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor) and PD98059, U0126 (ERK inhibitor) on TNF-α, IP-10 and IL-6 expression induced by MRP8/MRP14 in peritoneal macrophages. A: TNF-α; B: IP-10; C: IL-6. Data are from 3 independent tests, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MRP8/MRP14 group.

使用TLR4和RAGE受体拮抗剂预处理细胞鉴定MRP8/MRP14诱导细胞因子表达的受体，TLR4抑制剂TAK242显著抑制MRP8/MRP14诱导的TNF-α(P < 0.01)、IP-10(P < 0.01) 和IL-6(P < 0.05) 的表达，RAGE中和性抗体显著抑制IL-6(P < 0.05) 的表达(图 6)。

图 6(Figure 6)

图 6 TLR4和RAGE受体拮抗剂对MRP8/MRP14诱导腹腔巨噬细胞TNF-α、IP-10和IL-6表达的影响 Figure 6 Effect of TLR4 and RAGE receptor antagonists on TNF-α, IP-10 and IL-6 expression induced by MRP8/ MRP14 in peritoneal macrophages. A: TNF-α; B: IP-10; C: IL-6. Data are from 3 independent tests, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs MRP8/14 group.

巨噬细胞是参与机体天然免疫应答的重要细胞类型^[16]。腹腔巨噬细胞是腹腔常驻巨噬细胞，是机体天然免疫系统的第一道防线^[17]。本研究采用小鼠原代巨噬细胞，更接近体内真实情况，研究结果也更加准确。研究结果显示，MRP8/MRP14刺激小鼠腹腔巨噬细胞，能够显著诱导TNF-α、IP-10和IL-6的表达；同时MRP8/ MRP14能够诱导腹腔巨噬细胞p38 MAPK、JNK和ERK信号通路的活化; 进一步本研究使用通路特异性抑制剂从反面证实活化的信号通路与MRP8/MRP14诱导细胞因子表达的关系，结果提示TNF-α和IP-10的表达与p38 MAPK和JNK信号通路相关，而IL-6的表达则与p38 MAPK和ERK信号通路相关。

研究表明，细胞外MRP8/MRP14发挥功能主要依赖于与靶细胞表面特异性受体的结合。已报道MRP8/ MRP14的作用受体包括TLR4^{[8, 18]}、RAGE^[18-19]、CD36^[20]等。本研究通过封闭细胞膜表面RAGE和TLR4受体，观察MRP8/MRP14诱导细胞因子表达情况，结果发现封闭TLR4受体，TNF-α、IP-10及IL-6的表达均受到显著抑制，而封闭RAGE受体，则只有IL-6的表达受到部分抑制，提示TNF-α、IP-10的表达仅与TLR4受体相关，而IL-6的表达则是由TLR4和RAGE受体共同介导的。MRP8和MRP14属于钙结合蛋白，他们结构的典型特征是二者都包含两个钙结合手型(EF-hand)，即EF-hand 1和EF-hand 2, 而每一个EF-hand上存在一个钙结合位点(CB)^[20]。MRP14则有一个较长的羧基末端。研究表明位于氨基末端的EF手型基序与钙离子结合力较强，与钙离子结合后，通过改变蛋白构象，从而暴露出与靶蛋白的结合位点，通过与靶蛋白作用而发挥生物学效应^[21-23]。我们的研究结果显示，EF hand-1、EF hand-2及EF hand-1 +2结构域融合蛋白能够诱导TNF-α、P-10及IL-6的表达，这提示MRP蛋白以包含有Ca²⁺结合基序的结构域具有诱导细胞因子表达的生物学活性，MRP14对细胞因子表达的调控作用可能是Ca²⁺依赖性的，具体的机制我们需要采用钙离子螯合剂等其他方法进一步验证。

本研究采用的是细菌纯化的重组蛋白，关于原核蛋白LPS污染是大家比较争议的问题。因此我们设计了多方面实验来排除LPS的干扰:(1) 采用鲎试剂法检测重组蛋白中LPS含量，LPS < 0.25 EU/mL，基本可以忽略不计；(2) 多粘菌素B(PMB)除了作为革兰氏阴性菌感染治疗药物外^[24]，还可被用来清除各种试剂中的LPS，我们实验中使用20 mg/L PMB能够有效抑制100 ng/mL LPS的生物学活性，而这个LPS刺激浓度是蛋白中可能污染的LPS含量的上万倍，因此20 mg/L PMB能够充分有效的抑制重组蛋白中可能污染的LPS; (3) LPS热稳定性较高，在100 ℃下30 min仍可维持其活性，结果80 ℃加热30 min灭活了MRP8/MRP14重组蛋白的活性，而LPS则不受影响(实验数据未展示)。通过以上实验，我们可以排除融合蛋白LPS污染问题。

本研究筛选了MRP8/MRP14刺激腹腔巨噬细胞细胞因子表达谱，并探讨了p38 MAPK、JNK和ERK信号通路在其中的重要作用。本研究有助于我们深人认识MRP蛋白介导炎症反应的生物学机制。