巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）是CC类趋化因子家族的成员，对淋巴细胞和单核巨噬细胞具有特异性趋化吸引作用^[1]。其受体CCR5（CC亚族趋化因子受体5）是G蛋白偶联的趋化因子受体，主要表达在Th1淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞表面^[2]。在炎症中MIP-1β与CCR5的结合主要起到招募及细胞迁移的作用，是影响白细胞趋化作用的重要调节者^[3]。研究表明，在许多恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、肾癌等当中，都存在着宿主免疫细胞的浸润，而许多肿瘤细胞均能分泌趋化因子，这些趋化因子和不同细胞的特异性受体结合，在肿瘤的生长发育和转移分化的过程中发挥着重要作用^[4-6]。本课题组发现，在体外实验中人舌鳞癌细胞能够自分泌MIP-1β，并且舌鳞癌细胞和正常口腔黏膜上皮相比较，MIP-1β呈现高水平表达。但舌鳞癌肿瘤细胞是否能够表达MIP-1β的特异性受体CCR5，是否能够通过自分泌的方式影响肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为未见报道。本实验通过研究CCR5在不同人舌鳞癌细胞株的表达情况，及MIP-1β对人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨MIP-1β在舌鳞癌发生发展过程中的作用。

IB高速低温离心机（Eppendorf）；AS图像分析系统（Kontron elekronik）；激光共聚焦显微镜（Olympus）；倒置相差显微镜（Olympus）；垂直电泳仪和电泳装置（Bio-Rad）；流式细胞仪（BD FACSAri）；全自动酶标仪（Bio-rad）；核酸蛋白分子仪（Beckman）；胰蛋白酶（Sigma）；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基（Gibco）；胎牛血清（Hyclone）；一抗兔抗人CCR5抗原多克隆抗体（博奥森，北京）；二抗羊抗兔-Cy3（R & D）；重组人MIP-1β（PeproTech）；CCK-8（同仁）；人舌鳞癌细胞株Tca-8113（武汉大学中国典型培养物保藏中心购买）、UM-1（中山大学第一附属医院惠赠）、CAL-27（上海交通大学附属第九人民医院惠赠）。

在37 ℃、95%湿度、5% CO₂条件下，以含10%胎牛血清的DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640培养基分别培养CAL-27、UM-1、Tca-8113，待细胞长满培养瓶（25 cm²）底部70%~80%时，用0.25%的胰酶进行消化并传代，倒置显微镜下对细胞的形态进行观察，取对数生长期的细胞用于进一步的实验。

分别提取CAL-27、UM-1、Tca-8113细胞的总蛋白，考马斯亮蓝G-250法进行3种细胞的蛋白定量，各取40 μg蛋白用来进行12% SDS-PAGE凝胶电泳分析，待凝胶电泳结束后，将转移蛋白至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉于室温下封闭2 h后，加入1:1000稀释的兔抗人CCR5一抗，在4 ℃条件下过夜，用TBST洗膜，之后加入1:5000稀释的羊抗兔IgG（辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶标记），在室温条件下孵育1 h，用TBST洗膜，最后用DAB（AP）进行显色。

制备3种细胞的细胞爬片，用多聚甲醛进行固定，之后滴加封闭液，并滴加适当稀释过的一抗CCR5（1: 100），同时用PBS替代一抗作为阴性对照。在4 ℃条件下过夜，并用PBS进行洗涤，之后滴加相应的二抗羊抗兔-Cy3，在37 ℃条件下30 min后，用PBS进行洗涤，之后滴加4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色液进行复染，再用PBS进行洗涤，之后风干，再用抗荧光衰减封片剂进行封片，在激光共聚焦显微镜（CLSM）下进行观察。采用免疫荧光染色定量方法对所有间接荧光染色进行分析，操作人员在CLSM下逐一对切片进行单盲读片，之后再将读片所得的图像进行采集并输入计算机，对每张切片进行随机选择，选取3个代表视野，对选取的每个视野分别采集Cy3标记CCR5蛋白荧光图像、DAPI标记的核荧光图像及前两者的重叠图像各1幅。

取对数生长期的人舌鳞癌细胞CAL-27，用0.25%胰酶进行消化，之后用含10%胎牛血清的DMEM培养液对细胞进行重悬，将细胞密度调整至3.5×10⁴/mL，之后将其接种到96孔板当中，每孔接种的细胞悬液为100 µL，过夜；次日，更换为无血清DMEM培养液进行细胞培养；24 h之后再次更换为含0.5%胎牛血清的DMEM培养液进行细胞培养。根据MIP-1β的浓度，将细胞设置成为3个实验组（10、20、40 ng/mL）和1个对照组（PBS），每组设置3个复孔，将不同浓度的细胞因子加入到前述各个分组当中。另外，实验设置空白对照组，即与实验孔平行处不加细胞，只加相同体积的培养液。各实验组和对照组在MIP-1β作用12、24、48 h后，各孔均加入CCK-8溶液10 µL，继续孵育3 h，之后再用全自动酶标仪测定吸光度，实验以空白对照孔进行调零，选择波长为450 nm。

取处于对数生长期的人舌鳞癌细胞CAL-27细胞，用0.25%胰酶进行消化，调整细胞密度为1×10⁵/mL，将其接种于培养瓶中，之后用含10%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，过夜；次日，更换为无血清DMEM培养液进行培养；24 h后，再次更换为含0.5%胎牛血清的DMEM培养液。根据MIP-1β的浓度，将细胞随机分为3个实验组（10、20、40 ng/mL）和一个阴性对照组（PBS），同时，每组设置3个复瓶，加入IP-10，待24 h后，收集上述4组细胞，根据Annexin V/PI试剂盒的操作说明，通过流式细胞仪对CAL-27的凋亡进行检测。

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，分别采用析因分析和单因素方差分析，方差齐性检验显示方差齐性，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

人舌鳞癌细胞株CAL-27、UM-1、Tca-8113中均存在CCR5的表达，在相对分子质量为40 524处均可见蛋白表达条带（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 CCR5在不同人舌鳞癌细胞株的表达 Figure 1 Expression of CCR5 in different tongue squamous cell lines

免疫荧光细胞染色分析进一步证实人舌鳞癌细胞株CAL-27、UM-1、Tca-8113的胞膜及胞质内中均存在CCR5的表达（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 激光共聚焦显微镜观察CCR5在3种不同人舌鳞癌细胞株的表达 Figure 2 Expression of CCR5 in 3 different human tongue squamous cell line observed by laser confocal microscopy (Fluorescent dye, original magnification: ×400)

结果如图 3，析因分析显示：MIP-1β的浓度对CAL-27细胞增殖有影响（F=23.476，P=0.000），MIP-1β的处理时间对CAL-27细胞增殖也有影响（F=192.365，P=0.000），但时间和浓度之间无交互作用（F=1.761，P=0.150）；进一步的单因素方差分析显示：12、24 h时，不同浓度的MIP-1β对CAL-27细胞均有促进增殖的作用（P＜0.05）；48 h时，10 ng/mL、20 ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞有促进增殖的作用（P＜0.05），但40 ng/mLMIP-1β对CAL-27细胞无促进增殖作用（P＞0.05）。当MIP-1β的刺激浓度为40 ng/mL时，随着作用时间的延长，其促增殖的作用在减弱，在48 h对细胞增殖已无促进作用。

图 3(Figure 3)

图 3 MIP-1β在不同时间点对CAL-27细胞增殖的影响 Figure 3 Effects of MIP-1β on CAL-27 cell proliferation at different time points (*P < 0.05 vs 0 ng/mL, #P>0.05 vs 0 ng/mL)

和对照组相比，在24 h时，只有40 ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞的凋亡有促进作用（P＜0.05，表 1），10 ng/mL、20 ng/mL的MIP-1β对CAL-27细胞的凋亡无显著影响（P＞0.05，图 4）。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度的MIP-1β组CAL-27细胞的凋亡率 Table 1 Apoptosis rate of the CAL-27 cells exposed to different concentrations of MIP-1β (Mean±SD) Group Apoptosis rate (%) F P 0 ng/mL 0.053±0.473 10 ng/mL 2.565±1.629 20 ng/mL 4.330±4.218 40 ng/mL 8.167±1.105* 6.444 0.016 *P＜0.05 vs control group.

表 1 不同浓度的MIP-1β组CAL-27细胞的凋亡率 Table 1 Apoptosis rate of the CAL-27 cells exposed to different concentrations of MIP-1β (Mean±SD)

图 4(Figure 4)

图 4 流式分析4种不同浓度的MIP-1β对CAL-27细胞凋亡的影响 Figure 4 Flow cytometry analysis of apoptosis of CAL-27 cells treated with different concentrations of MIP-1β. A: 0 ng/mL; B: 10 ng/mL; C: 20 ng/mL; D: 40 ng/mL.

巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）为CC亚族细胞趋化因子之一，在其结构中有2个相邻的半胱氨酸残基，基因定位于人第17号染色体^[7]。MIP-1β的受体CCR5定位与5号染色体上，是一类表达于不同类型细胞（单核细胞、记忆T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞等）上的含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体，其天然配体有CCL-3（MIP-1a）、CCL-4（MIP-1β）、CCL-5（RANTES），配体与CCR5结合后，受体变构并与G蛋白结合激活信号转导通路，发挥相应的生物学作用，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集^[8-12]。

在肿瘤微环境中常常存在着慢性炎症, 大量的生长因子、趋化因子和蛋白水解酶所产生的免疫炎性反应有利于肿瘤的增殖、侵袭、粘附、血管生成以及对放、化疗的抵抗，促使恶性肿瘤产生和发展。在肿瘤组织中，浸润的淋巴细胞类型往往决定了肿瘤免疫的方向，而不同类型淋巴细胞的浸润是有特异性趋化因子的表达决定的。大量研究表明MIP-1β/CCR5轴不仅能够通过炎症反应来影响肿瘤的发生和发展，而且还可以通过与肿瘤相关基因的相互作用来调控肿瘤的发生、增殖和转移等过程^[13-17]。

在食管癌组织中，MIP-1β的表达量和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）（标记CD8⁺和Granzyme B）的浸润成显著相关性，CCR5主要表达在CD8⁺T淋巴细胞，且发现肿瘤组织中高表达MIP-1β的患者预示着较高生存率^[18]。人结直肠癌浸润的Treg细胞中发现CCR5高表达，并且有较强的增殖和激活能力^[19]。MIP-1a/CCR5轴能够调节瘤内白细胞和纤维细胞浸润，并且诱导巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶9（MMP-9），诱导纤维细胞分泌生长因子（HGF），促进肿瘤的生长和转移，促进血管生成，在小鼠肾癌细胞肺转移进程中^[20]。IL-1beta诱导肝细胞表达MIP-1β，后者趋化募集炎症细胞，为肝炎的发生甚至是肝癌的转化提供炎症微环境^[21]。Manes等^[22]认为能通过百日咳杆菌毒素、JAK-2和p38丝裂原激活的蛋白激酶途径调控p53基因在乳腺癌中的转录。但在口腔癌中，关于MIP-1β/CCR5轴的相关研究较少。本课题组前期应用蛋白质芯片技术在舌鳞癌细胞株中发现，肿瘤细胞能够高表达MIP-1β（和正常口腔黏膜上皮相比较）。而这种高表达的MIP-1β能否通过MIP-1β/CCR5轴对肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学行为发生影响是本研究的目的。

本研究分别采用蛋白印迹法和免疫荧光染色对3种不同的舌鳞癌细胞株（CAL-27、UM-1、Tca-8113）的MIP-1β的相应受体CCR5的表达进行检测，发现在3种人舌鳞癌细胞株中CCR5均有表达。通过免疫荧光染色可以清楚地观察到CCR5在细胞膜上有染色，但在细胞质内也有不同程度的染色。这说明CCR5不仅存在于细胞膜上，还存在于胞质内，这也为体外研究MIP-1β/CCR5轴对舌鳞癌细胞增殖和凋亡作用的研究奠定基础。但有研究发现，细胞质内CCR5在内质网合成并自身聚合形成同源寡聚体^[23]，或与其他趋化因子受体聚合形成异源二聚体发挥生物学效应^[24-25]。就本研究中细胞质内的CCR5的存在形式及生物学活性还需要进一步深入研究。

本实验在研究MIP-lβ对CAL-27细胞增殖影响时发现：当MIP-1β的刺激浓度相对较低（10 ng/mL、20 ng/mL）时，只有促进增殖的作用；当MIP-1β的刺激浓度相对较高（40 ng/mL）时，不但对肿瘤细胞有促进增殖的作用还促进其凋亡。剌激的早期以促增殖作用为主，但随着作用时间的延长，促增殖的作用在减弱，在48 h时，已无促进作用。这种促增殖作用的减弱可能是由于MIP-lβ的促凋亡作用逐渐发挥所引起的。但由于本实验只是检测了一个时间点（24 h时）肿瘤细胞的凋亡情况，不能反映出细胞凋亡情况随时间的变化，尚需以后进一步研究。

关于MIP-lβ对肿瘤细胞增殖和凋亡方面的研究尚未见文献报道，Ramesh等^[26]在研究CCR5介导的胞内信号转导通路时发现，MIP-lβ的刺激使转染CCR5的细胞胞内蛋白质络氨酸磷酸酶SHP1和SHP2磷酸化水平增强。而SHP1在信号转导中起负性调节作用，抑制细胞的生长与增殖；SHP2可激活Ras-Raf-ERK通路，在信号转导过程中对细胞增殖起正向调节作用^[27]。这给本实验研究带来了新的提示：MIP-1β对CAL-27细胞增殖和凋亡作用可能受SHP1和SHP2之间平衡的偏移的影响，但具体机制仍需进一步实验证实。

综上可以看出，MIP-1β/CCR5轴对人舌鳞癌细胞有着相互独立的作用：在体外实验中它既能促进肿瘤细胞增殖，促进肿瘤的进展，又能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的发展。在生物科学技术迅猛发展的当下，如何在增强趋化因子介导的抗肿瘤免疫应答的前提下，抑制趋化因子引起的肿瘤细胞增殖已成为肿瘤生物治疗的新的思路。