机体异常的免疫状态与肿瘤的发生发展关系密切^[1-2]。近期研究表明^[3-6]在喉癌、肺癌、膀胱癌、结肠癌等肿瘤患者外周血CD4⁺T细胞各亚群失衡。CD4⁺T淋巴细胞包括Th1、Th2、Th17及调节性T细胞（Treg）4个细胞亚群，这些亚群具有一定可塑性，通过细胞因子相互影响、制约来维持着动态平衡。在分化及功能上Th1/ Th2、Treg/Th17是两对相互制约的平衡体系，对维持机体免疫稳定发挥重要作用，一旦平衡被打破，机体会发生免疫功能失常，导致疾病的发生（炎症、肿瘤、免疫性疾病等）^[7-8]。研究证实Th1/Th2及Treg/Th17平衡状态与肾癌、肝细胞癌及肺癌等肿瘤的发生、发展和预后密切相关，Th1/Th2及Treg/Th17平衡失调预示了肿瘤的进展及不良预后^[9-11]。卵巢癌是危及女性健康的生殖系统三大恶性肿瘤之一，5年生存率仅有10%~20%。研究发现CD4⁺T细胞的亚群Th1细胞、Th2细胞、Th17及Treg细胞均与卵巢癌发生发展相关^[12-14]，但是Th1/Th2、Th17/Treg平衡状态与卵巢癌的关系还未见报道。通过研究卵巢癌患者体内Th细胞亚群分化水平及Th1/Th2、Th17/Treg平衡状态，探讨卵巢癌发病过程中CD4+辅助性T细胞亚群可能发挥的作用，为卵巢癌临床免疫治疗提供理论支持，将有助于改善卵巢癌预后。

收集蚌埠医学院第一附属医院2013年6月~2015年6月住院手术切除的上皮性卵巢癌患者30例，患者年龄21~75岁，所有患者均经病理学检查确诊。依据国际妇产科联盟（FIGO）2000年手术-病理分期标准，Ⅰ~Ⅱ期8例，Ⅲ~Ⅳ期22例，患者术前均未接受任何抗肿瘤药物治疗及生物免疫治疗。术后病理证实为：浆液性腺癌21例，粘液性腺癌9例；分化程度：低分化13例，中分化9例，高分化8例。另外，女性健康体检者20例为正常对照组。

美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪；eBioscience 85-15-0038-41 anti-human CD3 PE-Cy5 UCHT1、eBioscience 85-11-0087-41 anti-human CD8 FITC（Clone: SK1）、eBioscience 85-12-7049-41 Phycoerythrin（PE）anti-human IL-4（Interleukin-4, IL4）、eBioscience 85-12-7319-41 anti-human IFN-gamma PE 4S.B3、eBioscience 85-12-4714-41 Mouse IgG1, K Isotype Control PE、eBioscience 85-12-0699-41 Anti-Human CD69 PE（FN50）、Liankebio M LK-GAS003 FIX&PERM Kit Liankebio M LK-CS1001 PMA/Ionomycin mixture（250X）Liankebio M LK-CS1002 BFA/Monensin Mixture（250X）eBioscience 85-12-7178-42Anti-Human 85-12-7178-42Anti-Human IL-17A PE CD25 FITC、CD4 PerCP、CD127 PE来自美国BD公司，进口国内分装。

采集受试者清晨空腹外周静脉血3 mL，置入肝素钠抗凝管内。所有患者均在未接受手术、化疗及放射治疗前采血。将抗凝外周血用生理盐水1:1稀释，从离心管边缘轻轻加于Ficoll-Hypaque分离液上，室温500 g离心20 min，培养液洗涤3~5次。用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×10⁶/mL，用于流式细胞仪检测。

用Th1、Th2分泌的特异细胞因子IFN-r，IL-4来区分，并用CD3和CD8反设CD4细胞，以防PMA诱发细胞表面CD4分子被内吞。方法如下：将400 μL的肝素抗凝血与400 μL RPMI 1640培养液混匀后均分为A、B两管，A管中加入6.8 μL 0.1 mg/mL的monensin或8 μL 0.5 mg/mL的BFA，B管中加入10 μL 1 μg/mL的PMA、8 μL 50 μL/mL的monensin和6.8 μL 0.1 mg/mL的monensin（或8 μL 0.5 mg/mL的BFA）；混匀后置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养4~6 h。加入20 µL CD3-PE-Cy5和20 µL CD8-FITC，室温，避光孵育15 min。将A、B管分为4管，每管中加入100 µL已染色的全血，编号为A1、A2、A3、A4和B1、B2、B3、B4。每管加入ReagentA（固定液）100 µL，室温避光孵育15 min。加PBS洗涤，弃上清。再加入ReagentB（即破膜）100 µL，并分别加入Mouse IgG1-PE、IFN-γ-PE、Rat IgG1-PE、IL-4-PE。室温，避光孵育15 min。加PBS洗涤2次后弃上清。再加入0.5 mL多聚甲醛重悬细胞后上机检测。

取新鲜无菌肝素抗凝血和RPMI 1640培养液各100 μL混匀，分别加入佛波醇酯、离子霉素和布雷菲德菌素。在37 ℃、5% CO₂培养箱中刺激培养5 h，取出细胞。流式试管中分别加入CD3 APC单抗和CD4 PER-CP单抗，再加入100 μL经刺激培养的全血细胞，混匀后室温避光孵育20 min，溶血后加入固定剂100 μL，室温避光反应15 min，加入PBS洗涤，离心，弃上清。再加入破膜剂100 μL，同时加入IL-17PE单抗或者IgG 1PE同型对照，PBS洗涤2次，离心，弃上清。加入0.5 mL多聚甲醛混匀后上机检测，分析CD3⁺ CD4⁺IL-17A⁺细胞即Th17细胞频数。

取2只流式专用管，分别编号为Tr1、Tr2。Tr1管加入同型对照IgG1 FITC IgG2A PE，Tr2管加入Anti-CD25-FITC、Anti-CD4-Percp、Anti-CD127-PE 20 μL。再分别加入新鲜无菌肝素抗凝血100 μL，混均。置35 ℃水浴箱，避光孵育15 min。分别加入FACSLysing溶血液，置35 ℃水浴箱，避光孵育10 min。离心5 min，洗涤，两管各加入1%多聚甲醛0.5 mL。上机检测。

所有数据分析采用SPSS16.0进行，绘图采用Graphpad Prism4完成。两组间比较用成组t检验（A two-sample t-test），3组间比较采用方差分析和两两比较的SNK检验。

通过流式细胞术检测30例卵巢癌患者和20例健康对照外周血Th1、Th2、Thl7、Treg占CD3⁺CD4⁺T cell比率（图 1），并计算出Th1/Th2、Treg/Th17比值后进行统计分析，结果显示：卵巢癌患者Th1表达较健康对照明显降低（P < 0.05），Th2、Thl7及Treg表达均升高，与正常对照组比较均有统计学差异（P < 0.05）。分析卵巢癌患者和健康对照外周Th1/Th2及Treg/Th17比值变化发现，卵巢癌患者Th1/Th2较正常对照明显降低（P < 0.05），Treg与Th17比值（Treg/Th17）较正常对照组升高，有统计学意义（P < 0.05，表 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 卵巢癌患者及健康对照组Th1、Th2、Treg、Th17表达 Figure 1 Expression of Th1, Th2, Treg and Th17 in ovarian cancer patients and normal control subjects.

表 1(Table 1)

表 1 卵巢癌患者外周血Thl、Th2、Thl7、Treg的表达及Th1/Th2、Treg/Th17比值变化 Table 1 Percentages of Thl, Th2, Thl7 and Treg and Th1/Th2 and Treg/Th17 ratios in peripheral blood of patients with ovarian cancer Group n Th1 Th2 Treg Th17 Th1/Th2 Treg/Th17 Normal control 20 11.56±1.36 1.68±0.48 5.43±0.84 1.25±0.36 7.27±1.63 4.81±1.74 Ovarian cancer 30 6.28±0.80 4.06±0.63 16.24±2.18 2.76±0.51 1.63±0.44 5.95±0.57 P 0.00 0.00 < 0.05 0.00 < 0.05 < 0.05

表 1 卵巢癌患者外周血Thl、Th2、Thl7、Treg的表达及Th1/Th2、Treg/Th17比值变化 Table 1 Percentages of Thl, Th2, Thl7 and Treg and Th1/Th2 and Treg/Th17 ratios in peripheral blood of patients with ovarian cancer

进一步分析Thl、Th2、Thl7、Treg各亚群表达与卵巢癌病理因素关系，结果显示：Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌组Th1表达较Ⅰ~Ⅱ期明显减少（P < 0.05）。但与组织类型及细胞分化无关（P值分别是0.19、0.98）。在卵巢患者各组中，Th2、Thl7及Treg表达差异与组织类型、细胞分化无统计学意义（P > 0.05），3者表达与临床分期明显相关，Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌患者血清中Th2、Thl7及Treg表达均高于Ⅰ~Ⅱ期患者，两组间表达有差异（P < 0.05，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 卵巢癌患者外周血Thl、Th2、Thl7、Treg的表达与卵巢癌病理因素关系 Table 2 Correlations of Thl, Th2, Thl7 and Treg with the pathological factors of ovarian cancer (Mean±SD) Clinical features n Th1 P Th2 P Treg P Th17 P Pathologic stage  Ⅰ-Ⅱ 8 7.12±0.48 < 0.05 3.51±0.47 < 0.05 14.01±0.85 < 0.05 2.20±0.24 < 0.05  Ⅲ-Ⅳ 22 5.98±0.67 4.27±0.57 17.06±1.92 2.97±0.41 Type (adenocarcinoma)  Serous 21 6.16±0.78 > 0.05 4.07±0.66 > 0.05 16.53±2.26 > 0.05 2.84±0.49 > 0.05  Mucinous 9 0.81±0.27 4.06±0.59 15.62±1.99 2.32±1.00 Tissue differentiation  High differentiation 8 6.28±0.83 > 0.05 3.51±2.52 > 0.05 16.15±2.49 > 0.05 2.78±0.60 > 0.05  Middle differentiation 9 6.32±0.93 4.19±0.78 16.34±2.34 2.32±1.00  Low differentiation 13 6.26±0.74 4.18±0.50 16.23±2.04 2.78±0.46

表 2 卵巢癌患者外周血Thl、Th2、Thl7、Treg的表达与卵巢癌病理因素关系 Table 2 Correlations of Thl, Th2, Thl7 and Treg with the pathological factors of ovarian cancer (Mean±SD)

中国专家李呼伦教授^[15]领导的团队在国际上率先提出了“Th1、Th2、Th17、Treg细胞亚群功能失衡”理论，目前认识到Th1/Th2、Th17/Treg细胞的失衡与肿瘤密切相关。在不同细胞因子作用下Th0细胞（Th细胞前体）可以分化成不同的CD4⁺T细胞亚群，如Th1、Th2、Th17及Treg等。各亚群通过分泌相应的细胞因子发挥各自的作用，并相互影响制约。Th1细胞通过分泌白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，介导细胞毒性T细胞（CTL）及巨噬细胞激活，抑制B细胞功能。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子，促进B细胞激活与分化并产生抗体，介导体液免疫反应^[16-17]。肿瘤免疫主要是细胞免疫，Th1细胞诱导的免疫应答抑制了恶性肿瘤增生，肿瘤患者体内如果Th2细胞处于优势，机体细胞免疫功能会受到抑制，从而促进肿瘤发生、进展。研究发现，Th2型细胞因子IL-10及IL-6在喉癌、膀胱癌等肿瘤中成过度表达，而Th1细胞因子IFN-γ、IL-2表达水平显著降低，出现Th1向Th2的飘移，机体细胞免疫受到抑制^{[3, 5]}。本研究发现，与正常对照组比较，卵巢癌患者外周血Th1细胞明显下降（P < 0.05），而Th2细胞较正常对照组升高明显（P < 0.05），提示卵巢癌患者体内Th1细胞分化增殖被抑制，Th2细胞处于极化状态，进一步分析提示卵巢癌临床分期与Th1/Th2比例失衡相关，随着卵巢癌的进展，Th1细胞向Th2细胞漂移逐渐明显，机体免疫抑制进一步加重，导致癌细胞容易逃避细胞免疫监视，加速肿瘤的进展。

Th17细胞主要分泌IL-17、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，其功能主要是募集活化中性粒细胞，其中IL-17尚能促进树突状细胞的成熟，协同刺激T细胞的活化^[18]。研究证实，在自身免疫性疾病及炎症反应疾病中Th17细胞发挥重要作用，但在肿瘤中Th17细胞发挥的作用存在争议。在结肠癌、乳腺癌等肿瘤高水平的IL-17促进肿瘤的发展和转移^{[6, 19]}。但在γt-deficient小鼠肿瘤模型中，减少IL-17表达能够促进肿瘤生长，增强其表达后肿瘤生长受到限制，研究认为Th17通过募集Th1细胞发挥抗肿瘤效应^[20]。本次实验结果提示在卵巢癌外周血中Th17细胞百分率增多，并与临床分期相关，与细胞分化、组织类型无关。1995年Sakaguchi等^[21]首次证实Treg是一群具有免疫抑制作用的CD4⁺T细胞亚群，在多种实体肿瘤及血液系统恶性肿瘤Treg细胞数量明显增多。Treg主要通过分泌IL-10和TGF-β负向调节免疫反应以维持内环境稳态。在小鼠肝癌模型中，IL-10、TGF-β可以诱导肿瘤免疫耐受，促进肝癌细胞恶性增殖^[22]。在肝细胞癌患者Treg细胞通过促进肿瘤血管生成、降低CD8⁺T细胞而促进肝癌的进展，被认为是肝癌的一个预后不良指标^[23]。在卵巢癌患者外周血Treg细胞比例显著升高，并且与临床分期、生存时间密切相关^[11-24]。我们的实验发现卵巢癌患者外周血中Treg细胞百分率增高，并与临床分期显著相关，这与国内外研究结果基本一致，Treg可能参与了卵巢癌患者的免疫抑制，促进了卵巢癌的发生发展。

Treg细胞特异性的转录因子Foxp3可通过结合RORrt抑制其活性，而后者是Th17的特异性转录因子，Treg与Th17两种细胞相互抑制。在胃癌、肺癌中，当Treg/Th17平衡向Treg一方倾斜时，将有利于肿瘤的发展^[25-26]。本次研究发现卵巢癌患者外周血Treg/Th17比值（5.95±0.57）较正常对照组（4.81±1.74）明显升高（P < 0.05）。在卵巢癌患者外周血中Th17和Treg细胞均升高，随肿瘤进展，Treg细胞升高优势进一步加强。升高的Th17细胞在卵巢癌中是促进或抑制肿瘤进展难以判断，其具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，目前初步研究显示在卵巢癌患者外周血中CD4⁺T细胞亚群表达发生了变化，Th1/Th2和Treg/ Th17平衡被打破，出现Th2、Treg细胞极化，并且随病情进展极化进一步增强。下一步我们拟扩大样本量，进一步系统研究卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤及不同程度恶性肿瘤患者体内Th1/Th2和Treg/Th17细胞失衡及调节机制，为卵巢癌免疫治疗提供理论支持，有助于提高卵巢癌患者免疫治疗疗效。目前肿瘤免疫治疗已应用于临床，当肿瘤患者体内处于免疫抑制时，输入体内的免疫活性细胞或因子不能有效发挥效应，免疫治疗效果必将受到限制。全面了解在肿瘤发生发展过程中机体免疫状态及调节机制，将为逆转肿瘤细胞的免疫耐受提供理论支持，从而提高肿瘤免疫治疗临床疗效。