2017, Vol. 37
2. 蚌埠医学院, 科研中心, 安徽 蚌埠 233030
2. Department Science Research Center, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）常发生于缺血性心脏病的再灌注治疗过程中，随着MIRI研究的深入，人们发现MIRI的产生是一个多机制参与的复杂的病理过程，目前为止MIRI涉及的机制主要包括钙超载[1]、氧自由基增多[2]、炎症反应[3]、能量代谢障碍[3]、线粒体膜通透性转化孔的开放[4]、及各种信号通路的激活[5]、细胞凋亡[5]等。研究表明，内吗啡肽-1（EM-1）是一种μ阿片受体激动剂，具有强大的镇痛作用[6]。实验证明[7]，通过激动阿片受体，EM-1后处理可有效缓解心肌缺血再灌注损伤，但其中的具体机制尚未明确。
Erk1/2是促分裂原活化蛋白激酶家族中重要的一员，Erk1/2通路也是MIRI过程中的重要信号调节通路之一。研究表明EM-1能够在多种细胞中激活Erk1/2通路。Li等[8]发现经EM-1处理的小鼠树突状细胞，表现出Erk通路激活增强；Belcheva等[9]也发现EM-1可引起大鼠C6神经胶质瘤细胞中Erk通路的快速激活。那么在MIRI过程中，EM-1后处理是否也涉及Erk1/2通路的激活，目前未见相关报道。
因此本研究复制了在体大鼠MIRI模型，在EM-1后处理之前给予Erk1/2信号通路抑制剂PD98059干预，通过检测血流动力学指标心率（HR）、平均动脉压（MAP）、心率-血压乘积（RPP）反映大鼠的心功能变化；测定大鼠血浆心肌酶学指标肌酸激酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（ cTnI）、乳酸脱氢酶（LDH）指标，测定大鼠心肌梗死面积、及镜下观察大鼠心肌HE染色组织切片来反映各组大鼠的心肌损伤情况；检测大鼠血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等指标反映大鼠炎症反应及抗氧化能力；同时Western检测了Erk1/2、P-Erk1/2及其下游Cleaved Caspase-3蛋白的表达量以探索EM-1后处理对Erk1/2信号通路的影响。
1 材料和方法 1.1 实验动物SD雄性大鼠45只：SPF级，体质量270~290 g，购自蚌埠医学院实验动物中心[动物许可证号：SCXK2013（沪）2013-0006；合格证编号：2010002608616]。
1.2 主要试剂与仪器（1）主要试剂。EM-1（Sigma）、PD98059（Sigma），水合氯醛（沪试化学试剂），乳酸脱氢酶（LDH）、TNF-α、SOD、肌酸激酶（CK-MB）、IL-6和丙二醛（MDA）检测试剂盒（建成生物工程研究所），一抗：Erk1/2、P-Erk1/2、β-Actin抗体（Cell Signaling Technology）。二抗：HRP标记羊抗兔IgG抗体（博士德生物工程）、羊抗小鼠IgG抗体购自（Biosharp）。脱脂奶粉（Bio-rad）、PVDF膜和曝光液（Millipore）。（2）仪器。动物呼吸机（奥尔科技生物有限公司MED-LAB ALC-V9）、生物信号采集处理系统（美易科技有限公司MED-LAB U/4C501H）、EPOCH酶标仪（Biotek）。
1.3 方法 1.3.1 建立大鼠MIRI模型、实验分组依据Zhang等[10]的方法建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型。将45只SD雄性大鼠随机分为5组：假手术组（S组）、缺血再灌组（IR组），EM-1后处理50 μg/kg组（EM50组），内吗啡肽-1 50 μg/kg + PD98059（0.3 mg/kg）后处理组（EM50+PD组）、PD98059后处理组（0.3 mg/kg）后处理组（PD组）。（1）S组：仅在大鼠心脏的冠状动脉左前降支（LAD）下穿线维持150 min。（2）IR组：结扎LAD 25 min后，经大鼠股静脉注射生理盐水0.5 mL，缺血30 min后再灌注120 min。（3）EM50组：基本处理同IR组，再灌注前5 min静脉给予内吗啡肽-1 50 μg/kg。（4）EM50+PD组：基本处理同IR组，再灌注前5 min静脉给予PD98059 0.3 mg/kg，再给予内吗啡肽-1 50 μg/kg。（5）PD组：基本处理同IR组，再灌注前5 min静脉给予PD98059 0.3 mg/kg。
1.3.2 测定血流动力学指标BL-420E生物机能实验系统实时监测大鼠术中HR、MAP、RPP，RPP=HR×MAP，记录下各指标并对其进行统计学分析。
1.3.3 血清酶学及生化指标的测定灌注结束后，自大鼠颈总动脉采血5 mL于肝素抗凝管中，4500 r/min离心10 min分离血清，-20 ℃保存待测。收集各处理组血清后，分别检测SOD、MDA、IL-6、TNF-α、LDH、CK-MB、CTnI等指标。
1.3.4 心肌梗死面积测定造模结束后随即摘下心脏，于K-H液中将残余的血洗净，并将结扎冠状动脉的线再次扎紧，取1% Evans blue经主动脉注入心脏约2 mL，放入-80 ℃冰箱中冷冻约30 min，用手术刀片沿心脏纵轴垂直切成厚约2 mm薄片，将薄片浸没在1% TTC中，37 ℃水浴中避光染色15 min，后放入4%甲醛溶液固定，根据薄片上不同颜色划分区域，梗死区呈灰白色，非梗死区呈蓝色，危险区呈红色。通过Image-J测切片各区域面积，并计算梗死区所占危险区比值。
1.3.5 大鼠心肌HE染色取材梗死区心肌组织，将组织浸泡于4%多聚甲醛中，经过固定、脱水、透明、石蜡包埋、切片机中进行制片。切片用丙酮固定30 s~1 min、PBS浸洗3 min、苏木素染色3 min、双蒸水浸洗1 min、HCl-C2H5OH分化5 s、在水龙头的细流下冲洗5 min返蓝、然后在70% C2H5OH、80% C2H5OH、90% C2H5OH、95% C2H5OH、100% C2H5OH共5个染色缸中均浸洗2 min、伊红30 s~1 min、二甲苯浸洗2 min后，中性树胶封片，待其干燥后即可镜下观察。
1.3.6 Western blot检测P-Erk、Cleaved Caspase-3蛋白的表达实验结束后，准确留取缺血区心肌组织0.1 g加入1 mL蛋白提取液，冰上经过研磨器充分研磨后，将混合液吸入试管中，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min后取上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度，确定上样量为60 μg，经过上样缓冲液稀释、95 ℃ 5 min蛋白变性、加样、200 mA 120 min电泳转膜，5% BSA室温封闭120 min。1:2000 TBST稀释的兔源P-Erk抗体、1:1000 TBST稀释的兔源Erk抗体、1:500 TBST稀释的小鼠来源的β-Actin抗体分别加入孵育袋中，37 ℃孵育30 min，60 r/min摇床30 min，4 ℃过夜后取出重复上一步骤，TBST液洗涤（10 min/次）4次后分别加入1:12 000稀释的山羊抗兔二抗、1:5000稀释的山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育60 min，100 r/min摇床30 min，TBST液洗涤共4次（10 min/次），浸入曝光液并吹打均匀上机曝光，并对曝光结果进行灰度值统计分析。
1.3.7 统计学方法所有数据采用SPSS 21.0统计学软件进行处理，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠的血流动力学指标的变化实验结果表明，HR、MAP、RPP的基础值，各组均无统计学差异（P > 0.05）；与S组相比，IR组、EM50+PD组及PD组HR、MAP、RPP均有所下降（P < 0.05）；与IR组相比，EM50组的HR、MAP、RPP均有所升高（P < 0.05），说明EM-1后处理对再灌注的心肌功能起到一定的改善作用；与EM50组比较，EM50+PD组HR、MAP、RPP均有所下降（P < 0.05），同时PD组的HR、MAP、RPP也有所降低（P < 0.05），说明PD98059的加入减弱了EM50组改善心肌功能的作用（表 1）。
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表 1 各组大鼠HR、MAP、RPP的变化 Table 1 Hemodynamic parameters of the isolated rat heart (Mean±SD, n=6/group) |
乳酸脱氢酶（LDH）是心肌受损的标志物，心肌肌钙蛋白I（CTnI）在心肌受损早期即开始升高，其浓度有助于估计心肌梗死情况[11]，肌酸激酶（CK-MB）也是心肌缺血期的敏感指标，3个心肌酶学指标可用于评价心肌细胞的受损情况。实验结果可知，与S组相比，IR组LDH、CK-MB、CTnI的活性或浓度均有所升高；与IR组相比，EM50组的LDH、CK-MB、CTnI的活性或浓度有所降低（P < 0.05），说明EM50组对心肌细胞具有保护作用；与EM50组比较，PD组的CK-MB及EM50+PD组血浆中LDH、CK-MB、CTnI含量均有所升高（P < 0.05），说明PD98059的加入减弱了EM50组的心肌保护作用（图 1）。
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图 1 各处理组大鼠血清中LDH、CK-MB、CTnI的变化 Figure 1 Changes of LDH, CK-MB, and CTnI in different groups (Mean ± SD, n=6). &P < 0.05 vs S group; *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的终产物之一，也是细胞膜在功能和架构上氧化受损的标志物[20]，超氧化物歧化酶（SOD）是内源性抗氧化剂。实验结果表明，与S组相比，IR组的SOD活性是降低的，MDA含量有所升高（P < 0.05）；与IR组相比，EM50组的SOD活性增高，MDA含量有所降低（P < 0.05），提示EM-1后处理对心肌细胞具有一定的抗氧化作用；与EM50组相比，EM50+PD组和PD组的SOD活性均有所降低、MDA含量均有所升高（P < 0.05），说明PD98059的加入，使EM50组抗氧化作用有所削弱（图 2）。
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图 2 各处理组大鼠血浆SOD、MDA的变化 Figure 2 Changes of SOD and MDA in different groups (Mean±SD, n=6). & P < 0.05 vs sham (S) group; *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
炎症与心肌缺血再灌注过程密不可分[15]，TNF-α与IL-6可反映心肌缺血再灌注过程中的炎症程度。实验结果表明，与S组相比，IR组的TNF-α、IL-6含量均有所增高（P < 0.05）；与IR组相比，EM50组TNF-α、IL-6含量是降低的（P < 0.05），说明EM50组具有一定的抗炎作用；与EM50组相比，EM50+PD组、PD组的TNF-α、IL-6含量均有所增高（P < 0.05），PD98059的加入削弱了EM50组的抗炎作用（图 3）。
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图 3 各处理组大鼠血清中TNF-α、IL-6的变化 Figure 3 Changes of TNF-α and IL-6 in different groups (Mean±SD, n=6). & P < 0.05 vs S group; *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
TTC双染法测心梗面积，有助于评估大鼠心肌受损程度。根据薄片上梗死区（IS）呈灰白色，非梗死区呈蓝色，危险区（AAR）呈红色，使用Image-J软件计算梗死区所占危险区比值。与IR组相比，EM50组心肌梗死面积减少（P < 0.05）；与EM50组相比，EM50+PD组心肌梗死面积增加（P < 0.05，图 4）。
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图 4 各处理组下大鼠心肌梗死面积百分比 Figure 4 Percentage of myocardial infarction area in differenr groups (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
心肌组织HE染色反映了大鼠心肌组织形态学改变及局部炎症情况。S组：心肌细胞排列紧密整齐，肌纤维完整，间质中未见红细胞及炎细胞浸润；IR组：心肌纤维萎缩排列紊乱，间质扩大，血管扩张伴充血，多重区域间质红细胞外渗，局部区域白细胞浸润伴红细胞漏出，且该处心肌细胞消失，伴心肌细胞空泡变性；EM50组：心肌细胞排列较紧密，局部区域纤维排列紊乱呈波浪状，间质未见炎细胞浸润及红细胞；EM50+PD组：心肌纤维排列较紊乱，间质红细胞外渗，局部白细胞浸润伴红细胞漏出；PD组：心肌纤维排列紊乱，血管扩张伴充血，间质红细胞外渗，局部白细胞浸润伴红细胞漏出。大体上，IR组、EM59+PD组、PD组心肌受损程度较EM50组心肌受损程度重，IR组心肌组织的受损程度较S组心肌受损程度重（图 5）。
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图 5 各处理组大鼠心肌组织HE染色切片镜下结果 Figure 5 HE staining of the cardiac tissues in different groups (Original magnification: ×400). A: S group; B: IR group; C: EM50 group; D: EM50+PD group; E: PD group. |
与S组相比，IR组的P-Erk蛋白表达增高（P < 0.05），Cleaved Caspase-3表达增高；与IR组比较，EM50组心肌组织中P-Erk表达增高（P < 0.05），Cleaved Caspase-3表达降低（P < 0.05）；与EM50组比较，EM50+PD组心肌组织中P-Erk的表达降低（P < 0.05），Cleaved caspase-3的表达增高（P < 0.05，图 6、7）。
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图 6 各处理组下大鼠心肌中Erk1/2、P-Erk1/2蛋白表达情况 Figure 6 Expression of Erk1/2 and P-Erk1/2 proteins in rat myocardial tissue in different groups (Mean±SD, n=3/group). & P < 0.05 vs S group; *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
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图 7 各处理组下大鼠心肌中Cleaved Caspase-3蛋白表达情况 Figure 7 Expression of cleaved caspase-3 in rat myocardial tissue in different groups (Mean±SD, n=3/group). & P < 0.05 vs S group; *P < 0.05 vs IR group; #P < 0.05 vs EM50 group. |
由实验结果可知，EM50组能够改善缺血再灌注损伤心肌的心功能、保护心肌细胞，并且具有一定抗氧化、抗炎的作用，能减小大鼠缺血再灌注损伤心肌的心梗面积、减轻心肌组织病理学改变，以上均说明EM-1后处理具有一定心肌保护作用。此结果亦与ZHANG等人[10]的实验结果是一致的。
Erk1/2通路属于再灌注损伤补救激酶系统，是调控体内细胞生长、凋亡、增殖的重要信号转导通路。研究表明，当心肌发生缺血再灌注时，香芹酚、昔多芬后处理通过激活Erk1/2通路，上调Erk1/2蛋白磷酸化水平，可对心肌产生一定的保护作用[16-17]；Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键酶，研究表明磷酸化的Erk1/2可激活其下游的Caspase家族，引起Caspase-9的表达量增加和Caspase-3的表达量降低，从而抑制细胞的凋亡[18-19]，Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，也是心肌细胞凋亡的标志性蛋白[19-21]，随着Erk1/2通路激活、Caspase-3表达量的降低，Cleaved Caspase-3表达量也随之降低。那么，EM-1后处理过程中是否涉及了Erk1/ 2通路的激活，对Cleaved Caspase-3的表达影响如何。
我们使用Erk1/2通路的抑制剂PD98059阻断Erk1/2通路，再给予EM-1后处理，对大鼠心肌组织P-Erk1/2、Cleaved Caspase-3蛋白的进行检测。结果显示，与IR组相比，EM50组的P-Erk1/2表达量是增高的，Cleaved Caspase-3表达量有所降低；与EM50组相比，EM50 + PD组P-Erk1/2表达量有所降低，Cleaved Caspase-3表达量增高。说明EM50组激活了Erk1/2通路，并且EM50组对Erk1/2通路的激活作用可被PD98059阻断。
Chen等人[22]通过对离体MIRI大鼠心脏进行吗啡后处理，发现吗啡后处理组大鼠的血浆CK-MB含量有所降低、心肌功能有所改善、心梗面积显著较小并且以上作用可被PD98059阻断。He等[23]已证明，PD98059通过阻断Erk1/2通路，对吗啡预处理心肌保护作用起到抑制作用。以上说明激活的Erk1/2通路具有心肌保护作用。我们的实验表明，EM-1后处理能够改善大鼠在体缺血再灌注损伤心肌的心功能、保护心肌细胞，具有抗氧化、抗炎的作用，可减小大鼠心梗面积、减轻心肌组织病理学改变。使用PD98059阻断Erk1/2通路，再给予EM-1后处理，发现这些保护性作用被减弱，提示EM-1后处理可能通过激活Erk1/2通路发挥了心肌保护作用。
作为丝裂原活化蛋白激酶家族中的重要亚族，Erk1/2在调节细胞的生长、分化、应激以及死亡中起重要作用。Erk通路能够调节Bcl-2家族成员的活性[24]，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，而Bcl-2具有拮抗促凋亡蛋白Bax的表达、抑制细胞色素C的释放和Caspase-3的激活、抗氧化以及维持细胞内钙稳态的作用[25]。Erk的激活可以促进细胞ATP水平的恢复和稳定，以提供细胞足够的能量，从而抑制细胞损伤[26]。
EM-1属于μ阿片受体激动剂，研究表明EM-1通过其N端Tyr捕获自由基，形成Tyr自由基，提高心肌细胞的抗氧化能力，有效减轻氧化应激对心肌细胞造成的氧化损伤[27]。文献表明EM-1通过调节外周MOR抑制细胞因子的释放、抑制IL-6等炎症因子的分泌等机制发挥抗炎作用[28]。我们的实验结果也发现EM-1后处理可通过抗氧化、抗炎作用减弱心肌缺血再灌注损伤，并且此作用可被PD98059减弱。但EM-1的抗氧化、抗炎作用是否与Erk1/2通路的激活有关，有待进一步探索。我们推测EM-1后处理通过激活Erk1/2通路、下调Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平，抑制心肌细胞的凋亡，促进细胞ATP水平的恢复和稳定，心肌细胞受损减少、因而降低了释放入血的心肌酶（CK-MB、LDH、CTnI）含量；减少氧自由基的产生，减少炎症介质的释放。
综上所述，EM-1后处理通过改善心功能、保护心肌细胞、抗氧化应激、减小心梗面积发挥心肌保护作用，并且在此过程中可能涉及了Erk1/2通路的激活。
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