2017, Vol. 37
地中海贫血是最常见的人类单基因遗传病之一，中国南方地区，如广西、广东、云南等是高发流行地区[1-2]。中国人群地中海贫血以α地贫和β地贫为主，重型α地贫往往因为宫内贫血而胎死腹中或出生很快死亡。α地贫主要基因缺陷背景为大片段缺失，其中大约90%的α地中海贫血是由包含α珠蛋白基因簇或其调控区域的片段缺失所导致[3]。作为严重的公共卫生问题，其预防措施主要依赖于产前诊断和遗传咨询，而产前诊断和遗传咨询则依赖于地贫基因的明确[4-5]。目前常规的地贫基因检测不能检测到少见、罕见及新发现的地贫基因。因此，对血常规参数和常规地贫基因检测不相符的标本，应进一步明确其是否存在其它地贫突变基因。本研究发现一种未见报道的缺失α地贫突变基因，同时建立其检测方法，丰富了α地贫基因突变图谱。现报道如下：
1 对象和方法 1.1 对象先证者：男，41岁，汉族，海南省人，地贫筛查怀疑为地贫基因携带者，进行地中海贫血基因检测确认；先证者母亲：女，65岁。
1.2 标本采集采集先证者及其母亲外周血2~3 mL，乙二胺四乙酸（EDTA-2K）抗凝。
1.3 仪器及试剂AB 9700聚合酶链反应仪购自美国ABI公司，UVP凝胶成像系统购自美国Gene有限公司，NANODROP 2000核酸测定仪购自美国Thermo公司。Taq DNA聚合酶（Ex Taq）为大连TAKARA宝生物工程有限公司产品，缺失α地贫基因检测试剂盒、非缺失α地贫基因检测试剂盒及β地贫基因检测试剂盒均为深圳益生堂生物企业有限公司产品。
1.4 血液学表型分析RBC参数分析采用日本Sysmex XS-800i全自动血液分析仪；Hb组分定量分析采用毛细血管电泳法，检测仪器Capillarys2 Flex Piercing及配套试剂均为法国SEBIA公司产品。
1.5 血清铁和血清铁蛋白检测采用美国Beckman公司生化分析仪DXC800和DXI800及配套试剂。
1.6 常规缺失α地贫基因检测基于跨越断裂点PCR（gap-PCR）原理的多重PCR检测α地中海贫血基因缺失突变，检测类型包括--SEA、-α3.7、-α4.2及--THAI。操作严格按照试剂说明书进行。
1.7 α、β地贫基因点突变检测PCR-反向斑点杂交技术（PCR-RDB）诊断α、β地中海贫血基因点突变。操作严格按照试剂说明书进行。α地贫基因点突变包括Hb Constant Spring（αCS）、HbQuong Sze（αQS）和HbWestmead（αWS），β基因点突变包括CD41-42、IVS-Ⅱ-654等中国人群常见的的8种β-地贫基因非缺失突变和不常见的7种β-地贫基因非缺失突变。
1.8 α1基因扩增引物序列：a1（F）：5'-TGGAGGGTGGAGACGT CCTG-3'，a1（R）：5'-TCCATCCCCTCCTCC CGCCCC TGCCTTTTC-3'。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。gap-PCR检测体系：2 mmol dNTP 2.0 μL，5×buffer 4.0 μL，25 mmol MgCl2 2.0 μL，Taq酶1 U，10 μmol引物各0.5 μL，模板2 μL，加超纯水至20 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；97 ℃ 45 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 120 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。电泳条件：1.5%琼脂，100 v，60 min。
1.9 针对位点特异的缺失α地贫基因检测利用gap-PCR检测新发现的缺失α地贫基因。PCR引物序列：3814（F）：5'-CTCGGTAGCCGTTCCTCCT G-3'，3814（R）：5'-GGACTTCGCGGTGGCTCCAC-3'。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。gap-PCR检测体系：2 mmol dNTP 2.0 μL，5×buffer 4.0 μL，25 mmol MgCl2 2.0 μL，Taq酶1 U，10 μmol引物各0.5 μL，模板2 μL，加超纯水至20 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 180 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。电泳条件：1.5%琼脂，100 v，70 min。取3 μL扩增产物进行电泳验证，将电泳产物送广州英骏生物技术有限公司测序，分析测序峰图，并与GenBank中标准序列（NG_000006.1）进行比对，以确定缺失的范围和断裂位点。
2 结果 2.1 血液学表型分析结果（表 1）
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表 1 先证者及其母亲血液学检测结果 Table 1 Hematological testresults of the proband and his mother |
先证者地贫筛查结果提示，先证者可能为轻型α地贫携带者。
2.2 常规缺失α地贫基因检测gap-PCR检测结果显示，先证者检测出代表正常α珠蛋白基因的1.7 kb条带和代表左缺4.2 kb的1.4 kb条带，其基因型为（-α4.2/αα）；其母亲只有正常条带，故基因型为αα/αα（图 1）。
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图 1 缺失α地贫基因检测结果 Figure 1 Detection for deletional α-thalassemia gene. 211: Proband(-α4.2/αα), 200: Mother(αα/ αα). P: Positive(-α4.2/αα), N: Control(αα/αα). |
PCR-RDB检测结果显示，先证者标本PCR扩增没有扩增产物，3个位点αCS、αQS和αWS的正常对照及相应突变点均无显示蓝点（图 2）。
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图 2 PCR-RDB检测α地贫基因非缺失突变结果 Figure 2 Detection for non-deletional α-thalassemia gene. A: proband (no PCR product); B: Mother(αα/αα); C: Positive (ααcs/αα); D: Control(αα/αα). |
先证者及其母亲均没有检测到17种β-地贫基因非缺失突变。
2.5 单独扩增α1基因α1基因进行单独扩增，先证者标本无扩增产物，其母亲及正常对照标本均扩增出正常1.1 kb产物条带（图 3）。
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图 3 α1基因PCR扩增结果 Figure 3 Detection result of α1 hemoglobin gene. 211: Proband (no PCR product), 200: Mother, N: Control. |
设计特异引物，利用gap-PCR技术，针对新发现的缺失α-地贫基因进行检测、验证。
电泳结果显示，正常对照标本出现4.0 kb条带，而先证者标本无此条带，反而扩增出约250 bp条带，其母亲则同时扩增出4.0 kb和约250 bp条带（图 4）。
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图 4 针对断裂点的特异gap-PCR扩增结果 Figure 4 Specific PCR for detecting the breakpoint region. 211: Proband, 200: Mother, N: Control. |
将gap-PCR扩增的特异产物进行测序，正反双向测序结果显示电泳条带长度为268 bp。将测序结果在NCBL网站与NG_000006.1序列进行BLAST比对，比对结果发现，该缺失α-地贫基因缺失片段断裂范围在34 592~38 405 bp，缺失片段长度为3814 bp(NG_ 000006.1: g.34592_38405del3814)，丢失片段包括编码血红蛋白亚基α1的HBA1基因（图 5、6）。
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图 5 α3.8地贫基因断裂处序列 Figure 5 DNA breakpoint of -α3.8 thalassemia. |
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图 6 扩增产物与NG_00006.1序列比对结果 Figure 6 Alignment results between the PCR product and NG_00006.1. |
α地中海贫血是高度异质性的单基因遗传病，其分子病理基础为α珠蛋白基因片段的缺失或位点突变导致α珠蛋白肽链合成减少或不能合成而导致溶血性贫血。迄今为止，全球至少已经报道了40多种α地贫基因缺失类型，在中国人群中发现的超过10种[6-8]。目前，国内α地贫基因诊断主要包括中国人常见的4种α地贫缺失型（缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2及--THAI）和3种非缺失型基因突变类型（αCS、αQS和αWS点突变类型）。由于方法的局限性，一些少见甚至未曾报道的突变类型则需要机遇、敏锐以及进一步实验探究发现。
本研究中的先证者，由于血液学指标筛查疑为缺失两个α珠蛋白基因的轻型地贫，故进行常规缺失α地贫基因、非缺失α地贫基因及β-地贫基因检测。检测结果显示，先证者未检测出β-地贫基因，缺失α地贫基因检测结果为缺失一个α珠蛋白基因的静止型α地贫（-α4.2/αα），非缺失α地贫基因检测结果为没有扩增产物。由于缺失及非缺失α地贫基因检测结果矛盾，且血液学筛查结果提示为轻型α地贫而常规基因检测结果为静止型α地贫，故推测该样本可能存在其它少见缺失型α地贫基因，从而导致非缺失α地贫基因扩增无产物。
针对这异常检测结果，首先对α1基因进行单独扩增，以确定该标本有无缺失α1基因。扩增结果显示：正常对照标本则扩增出预期1.1 kb产物条带，而先证者标本无扩增条带，提示该标本缺失α1基因，且缺失下游部位可能位于α1下游区域。
从常规非缺失α地贫基因检测结果可以推测，该断裂片段可能包括非缺失α地贫基因扩增引物序列，初步推断缺失断裂点可能位于α2基因第三外显子下游部位，由于缺失片段大小无法确定，在确定α1缺失后，针对可能的突变位点，设计多对引物重新扩增，多组扩增结果显示，只有引物3.8（F）及3.8（R）扩增出预期结果，该标本与正常对照标本相比，没有4.0 Kb条带，反而出现了约250 bp条带。将产物测序后，通过与序列NG_ 000006.1比对，发现该缺失α地贫基因缺失片段断裂范围在34 592~38 405 bp之间，缺失片段长度为3814 bp，缺失部分包括完整α1基因，因此，先证者α地贫基因型为-α4.2/-α3.8。由于该3.8 kb缺失部位包含常规非缺失α地贫因检测中PCR扩增下游引物的结合位点，故常规非缺失α地贫基因检测无法进行PCR扩增，导致其非缺失α地贫基因检测膜条没有显色点。而先证者由于缺失两个α珠蛋白基因，虽然血红蛋白浓度正常，但其MCV及MCH均降低，符合α轻型地贫临床表现。
在PubMed上进行文献检索，以及查询珠蛋白基因网站（http://globin.cse.psu.edu/），均未发现此缺失突变类型，证实此缺失突变是世界首报的新型缺失α地贫基因型（GenBank登录号：KY472788）。
gap-PCR是目前检测缺失α地贫基因的常用方法[9-10]。除了常见的缺失类型外，也可能存在一些少见或尚未发现的地贫基因，同样都可以利用多重连接探针扩增技术（MLPA）和gap-PCR技术进行分析和鉴定[11-12]。本研究中，针对3814 bp缺失片段，通过在其断裂处上、下游设计特异引物，不仅可以用于分析其缺失片段分子生物学特征，而且还可以用于此新型地贫基因的临床快速检测、鉴定。
致谢: 感谢深圳益生堂生物企业有限公司的指导和帮助，谨此致谢！| [1] | Rund D. Thalassemia 2016: modern medicine battles an ancient disease[J]. Am J Hematol, 2016, 91(1): 15-21. DOI: 10.1002/ajh.24231. |
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