2017, Vol. 37
, 2. 青海省人民医院骨科，青海 西宁 810007
2. Department of Orthopedics, Qinghai Provincial
腰椎间盘突出症（LDH）是引起腰痛最常见的原因[1-2]。约一半的人在一生中都会经历腰痛，给社会和家庭增加了沉重的负担[3-4]。研究认为，LDH主要由环境和遗传易感基因相互协同作用导致的一种复杂性疾病[5-6]；其中遗传是其重要的危险因素之一[7-8]。
腰椎间盘退变是LDH的病理学基础[9]，许多研究表明细胞凋亡参与了腰椎间盘的退变；而椎间盘的髓核细胞凋亡是依赖于Fas/FasL死亡诱导信号复合体介导的通路，在正常髓核细胞中FasL表达显著高于退变的髓核细胞[10-13]。在之前的研究证实FasL-844T/C（rs763110）基因多态性与腰椎间盘退变和LDH相关[14]。但既往研究尚未结合退变的腰椎间盘髓核组织进行相关基因多态性研究，特别是FasL-844T/C基因多态性、腰椎MRI表现与退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达的关联性未见报道，本项目是研究FasL-844T/C基因多态性、腰椎MRI表现和退变的腰椎间盘髓核组织中FasL表达之间的关系；为进一步从调亡基因多态性、MRI和组织形态学的角度研究腰椎间盘退变性疾病提供新的依据。
1 资料和方法 1.1 研究对象研究选取陕西省人民医院骨科，西安市唐城医院脊柱外科自2008年1月~2013年6月间行开放手术治疗LDH患者105人，全部为无血缘关系的北方汉族。纳入标准：（1）有LDH的临床症状及体征；（2）核磁共振证实存在腰椎间盘突出；（3）经术中证实无纤维环破裂。排除标准：（1）患有Bechterew's病、先前有脊椎骨折、脊柱肿瘤、腰椎管狭窄症、脊髓灰质炎等脊柱疾患者；（2）行椎管内封闭、臭氧、胶原酶及射频消融等治疗；（3）患有自身免疫性疾病者；（4）术中发现纤维环破裂者；（5）椎间盘突出伴有钙化。并采集性别、年龄、吸烟状况及腰椎负荷大小[15]，1（很轻）=无固定职业，且很少有体力劳动；2（轻）=工作以坐位为主；3（中）=工作以弯腰扭腰和全身震动为主；4（重）=工作以提举重物和重体力劳动为主。MRI扫描的T2加权像时TE为90 ms，TR为2500 ms，层厚/层距为5 mm。椎间盘退变情况根据MRI中椎间盘信号强度变化进行判断，分级评定按照Schneiderman 4级法评[16]：1级椎间盘信号无缺失；2级椎间盘信号中度缺失；3级椎间盘信号重度缺失；4级椎间盘信号完全缺失。然后根据5个腰椎间盘退变情况得出总的积分0~15[17]。
1.2 基因多态性分析提取患者静脉血样中的全基因组DNA，用DNA分光光度计(NanoDrop ND-100，美国）检测全基因组DNA的浓度和纯度。样本基因型采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。PCR引物和单碱基延伸引物都是用Assay Designer（Sequenom）软件包设计。
SNP分型是由上海邃志生物科技有限公司利用美国Sequenom公司的MassARRAY系统完成，该系统是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF）。所有需要分型的DNA样本都稀释到5 ng/µL，取1 µL DNA样本，将其与0.95 µL水、0.625 µL PCR缓冲液（含15 mmol MgCl2）、1 µL的2.5 mmol dNTP、0.325 µL的25 mmol MgCl2、1 µL PCR引物以及0.1 µL HotStarTaq酶（Qiagen）混合在一起。PCR反应条件：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45个循环；最终72 ℃ 3 min。PCR扩增后，剩余的dNTP将被去磷酸消化掉，反应体系包括1.53 µL水、0.17 µL SAP缓冲液、0.3 U碱性磷酸酶。该反应在37 ℃进行40 min，然后85 ℃ 5 min使酶失活。碱性磷酸酶处理后，针对SNP的单碱基延伸引物在下列反应体系中进行：0.755 µL水、0.2 µL 10×iPLEX缓冲液、0.2 µL终止混合物、0.041 µL iPLEX酶，0.804 µL 10 µmol的延伸引物。单碱基延伸反应在下列条件下进行：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s 5个循环，共40个循环；最后72 ℃ 3 min。在终止反应物中加入6 mg阳离子交换树脂脱盐，混合后加入25 µL水悬浮。使用MassARRAYNanodispenser将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由MassARRAY RT软件系统（版本号3.0.0.4）实时读取，并由MassARRAYTyper软件系统（版本号3.4）完成基因分型分析。
1.3 椎间盘髓核的免疫组化研究（1）术中获得的腰椎间盘髓核组织后，立即用10%甲醛固定，制成蜡块备用；（2）切片机连续切取5 μm厚的切片；所有标本均在同一条件下，采用S-P法染色：石蜡切片脱蜡→3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶活性→抗原修复→血清封闭→加工作浓度为1:50的一抗→加一滴酶标记的二抗→加链霉素亲生物素-过氧化物酶溶液染色→DAB显色→苏木素复染，中性树胶封固。（3）结果判定：对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色强度分别进行分级记分；细胞核仅着蓝色者为阴性，凡细胞浆有棕黄色颗粒者为阳性细胞。阳性细胞率即阳性细胞占计数细胞的比例，每张切片随机取10个40× 10倍视野细胞进行观察；0分为阴性，1分为弱阳性，2分为阳性，3分为强阳性；积分=各积分（染色强度×染色的百分比）之和/10。。
1.4 统计学分析使用SPSS17.0统计软解包（SPSS, Inc., Chicago, IL, USA）进行统计分析。非参数检验分析研究对象的特征，椎间盘髓核FasL的表达和基因型之间的关联使用Student's t检验分析，腰椎间盘退变积分和髓核组织FasL表达的关系采用相关性分析；所有的检验都为双尾检验，P < 0.05认为是差异有统计学意义。
2 结果 2.1 研究对象的基本资料FasL-844 CC基因型者52例，FasL-844 CT基因型者40例，FasL-844 TT基因型者13例。3种基因型患者在年龄、性别、腰椎负荷及吸烟方面是匹配的（表 1）。
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表 1 研究对象的特征 Table 1 Characteristics of the patients with lumbar disc herniation (n, %) |
3种基因型患者腰椎间盘MRI退变积分的情况见表 2；携带CT和TT基因型的个体其腰椎间盘退变积分高于携带CC基因型的个体，TT和CC基因型之间有显著性差异（P=0.003），但是CT和CC基因型之间无显著性差异（P=0.058）。本研究发现，携带FasL-844 TT基因型的个体，其椎间盘退变更严重。
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表 2 FasL-844T/C基因多态性和腰椎间盘退变间的关系 Table 2 Associations between FasL-844T/C gene polymorphisms of and the severity of disc degeneration |
3种基因型患者腰椎间盘髓核FasL的表达的情况（表 3），与FasL-844 CC基因型携带者相比，FasL-844 TT基因型携带者腰椎间盘髓核中FasL的表达有显著差异（P=0.048）；但FasL-844 CC基因型携带者和FasL-844 CT基因型携带者之间腰椎间盘髓核中FasL的表达无显著差异（P=0.264）。
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表 3 FasL在髓核组织中的表达强度 Table 3 Expression level of FasL in the nucleus pulposus in patients of different genotypes of FasL-844T/C gene |
腰椎间盘退变和FasL在髓核组织中表达之间的关系（表 4）；从表中看可以看到，无论是全体样本还是各基因型分类样本，腰椎间盘退变总积分和FasL在髓核组织中表达总积分之间的相关性不具有显著性差异，即腰椎间盘退变程度和退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达的强弱无相关性。
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表 4 腰椎间盘退变和FasL在髓核组织中表达之间的关系 Table 4 Associations between the severity of disc degeneration and expression level of FasL in the nucleus pulposus |
LDH是指在椎间盘退变的基础上，髓核从破裂的纤维环和软骨终板突出刺激或压迫神经脊髓引起的临床综合症。目前，LDH的发病机制并不明确，过去数十年的研究证实，遗传因素在LDH中发挥效应[5]。Fas/ FasL介导死亡复合体信号通路参与了腰椎间盘退变的过程[10-13]，与FasL相关的免疫赦免失衡也参与了腰椎间盘退变[18-20]，且FasL-844T/C基因多态性与腰椎间盘退变和LDH相关[14]。本研究证实，FasL-844T/C基因多态性与退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达存在相关性，但腰椎间盘退变程度和退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达强弱无相关性。
为了尽可能降低研究混杂因素，首先我们选择术中证实无纤维环破裂的标本作为研究对象，以降低免疫赦免导致的偏差。据报道，Fas和FasL的相互作用可以调节器官的免疫应答，活化的细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞既可以表达Fas也可以表达FasL，FasL在淋巴细胞介导的细胞毒性方面发挥着重要作用[21-22]。当CTL和NK细胞识别靶细胞后，就可以活化并表达FasL，FasL可以与靶细胞表面的Fas结合，诱导靶细胞凋亡[23-24]。相反地，靶细胞也可以利用此机制进行“反攻击”，即当靶细胞表达FasL时，也可以诱导CTL和NK细胞凋亡而获得免疫赦免。研究证实，FasL在正常髓核中明显表达，且在维持髓核的免疫赦免中发挥着关键的作用[25-26]。纤维环破裂将会使椎间盘外更多淋巴细胞侵润，诱发免疫赦免反应导致髓核细胞表面FasL大量被消耗，引起髓核细胞死亡影响研究结果，故我们没纳入纤维环破裂的标本。其次，两种基因型的研究对象在年龄、性别等其他方面也是相匹配。
FasL-844T/C多态性位于FasL启动子区，在CAAT/enhancer-binding protein β转录因子的结合基序。FasL-844C等位基因可比T等位基因产生更高水平的FasL表达[27]。研究发现携带FasL-844TT基因型者患LDH的风险是携带FasL-844CC基因型者的3.12倍[14]；本次的研究结果仍支持上述观点，即携带FasL-844 TT基因型的个体，其椎间盘退变更严重。孙正明等推测，对于携带FasL-844TT基因型的个体，其椎间盘髓核中FasL的表达较携带FasL-844CC基因型的个体的低，过低表达的FasL与侵润到椎间盘内活化的淋巴细胞表面Fas结合的机会减少，致使活化的淋巴细胞凋亡降低，即椎间盘组织获得免疫赦免的机会降低，引起椎间盘组织发生破坏性的免疫反应，最终导致LDD加速[14]。
本研究发现FasL-844 C/T多态性3种基因型携带者髓核细胞表达FasL的积分是有差别的，FasL-844 CC基因型最高，FasL-844 C/T基因型次之，FasL-844 TT基因型最低；且与FasL-844 CC基因型携带者相比，FasL-844 TT基因型携带者髓核细胞表达FasL的积分有显著性差异，进一步同时从基因和组织学角度证实了FasL-844 C/T多态性与腰椎间盘退变和LDH相关。但是，进一步研究提示，无论是全体样本还是各基因型分类样本，腰椎间盘退变程度总积分与退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达积分无相关性，提示腰椎间盘MRI表现和椎间盘髓核组织FasL表达无相关性。此外，我们应该关注以下因素可能影响研究结果：（1）样本量、特别是FasL-844 TT基因型不够大；（2）部分患者纤维环可能存在肉眼不能发现的微小裂隙，椎间盘外淋巴细胞侵入诱发髓核产生免疫反应。
总之，我们的研究提示，FasL-844T/C基因多态性与LDH患者的椎间盘髓核组织FasL表达存在相关性，腰椎间盘退变程度和退变的腰椎间盘髓核组织FasL表达强弱无相关性；此结果需要进一步扩大样本量和更严格的设计来验证。
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