结直肠癌是我国主要的恶性肿瘤之一，高居发病率第4位，在发达地区已经接近或达到高发国家的水平^[1]。近年来，随着对肿瘤细胞信号传导研究的不断深入，以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的抗EGFR单克隆抗体分子靶向药物已经成为治疗转移性结直肠癌（mCRC）患者有效的手段之一，如西妥昔单抗和帕尼单抗^[2-3]。然而，并非所有mCRC患者都能从抗EGFR单克隆抗体药物的使用中获益。以往报道已表明^[4-5]，携带KRAS基因外显子2突变的患者对西妥昔单抗或帕尼单抗原发耐药。而近年的研究更是发现，RAS基因（包括KRAS和NRAS基因第2、3、4外显子）突变的人群不能从西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗中获益，反而可能增加不良反应风险^[2-3]。因此，决定是否使用抗EGFR单克隆抗体治疗mCRC之前，必须明确RAS基因突变状态。

目前结直肠癌的RAS基因突变检测是在获得肿瘤组织的基础上进行的，但肿瘤组织进行检测存在获取率低、难以避免时间和空间上异质性等问题^[6-9]。来源于血液的循环游离DNA（cfDNA）样本进行肿瘤基因检测具有获取方便，可提供系统综合性遗传信息，可反复采血动态监测疾病等特点，较肿瘤组织样本提取的DNA更具优势，可使得临床工作更加及时地获得患者的基因突变信息。目前cfDNA在肺癌的基因检测领域研究数据及临床应用较多，但在mCRC的治疗药物疗效预测以及疾病预后的领域的研究数据尚少，有深入研究价值。

本研究拟采用灵敏度高的多重荧光PCR技术对结直肠癌患者cfDNA样本进行RAS基因（包括KRAS基因第2、3、4外显子和NRAS基因第2、3、4外显子）检测分析，对比肿瘤组织样本的检测数据，以期探索两种样本的RAS基因突变结果的一致性，并评估结直肠癌患者RAS基因突变频率，研究cfDNA样本RAS突变状态和患者临床特征的关系。

收集2015年2月~2016年2月间佛山市第一人民医院肿瘤中心收治的71例结直肠癌患者的临床资料信息，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分期、肝转移情况、肺转移情况、血清肿瘤标志物水平（CEA、CA199）等。每例患者均采集血液标本并收集相应肿瘤组织标本。每例患者均由有资质的病理医师确诊为结直肠癌。本项研究已通过佛山市第一人民医院伦理委员会的审核批准。病例纳入标准：（1）临床及病理确证为结直肠癌的患者；（2）血液标本及组织标本采集前患者未行化疗、放疗或靶向治疗；（3）有签署知情同意书；（4）患者可获取肿瘤组织及血液两种类型标本；（5）血液标本采用EDTA抗凝，未发生溶血、腐败、变质；（6）肿瘤组织样本经病理确认。病例排除标准：（1）标本污染；（2）未按标本采集方法采集标本；（3）合并其他类型肿瘤者；（4）临床资料不全者。

采患者抗凝静脉血4~8 mL，2 h内低温离心10 min，3000 r/min。取上清至新离心管中，再次离心10 min，13 000 r/min，取上清血浆于-80 ℃冰箱储存备用。患者肿瘤组织标本离体后经中性福尔马林浸泡，石蜡包埋处理。每例组织标本均经病理评估确认含有肿瘤细胞（含量不低于30%）。

血浆标本及组织标本的DNA提取均采用厦门艾德生物医药科技有限公司的核酸提取试剂盒，均按试剂盒说明书提取DNA。DNA于-20 ℃冰箱储存备用。

血浆cfDNA的RAS突变检测采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类KRAS/NRAS基因突变联合检测试剂盒（多重荧光PCR法），组织DNA的RAS突变检测采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的人类KRAS/NRAS基因突变联合检测试剂盒（荧光PCR法），均按试剂盒说明书操作。血浆和组织的RAS突变检测位点均包括：KRAS外显子2（G12S、G12D、G12C、G12R、G12V、G12A、G13C、G13D）、KRAS外显子3（A59T、Q61K、Q61L、Q61R、Q61H）、KRAS外显子4（K117N、A146T、A146V、A146P）、NRAS外显子2（G12D，G12S，G13D，G13R、G12C、G12V、G12A、G13V）、NRAS外显子3（Q61R、Q61K、Q61L、Q61H）、NRAS外显子4（A146T）。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。两种标本的检测方法比较采用一致性检验。计数资料采用率描述，卡方检验进行比较分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

血浆cfDNA的RAS突变率为32.39%，组织DNA的RAS突变率为50.70%，两种标本的RAS突变检测的一致率为76.06%。血浆cfDNA与组织DNA的RAS突变检测结果一致（Kappa=0.523，P=0.000，表 1）。血浆cfDNA RAS检测的敏感性为58.33%、特异性为94.29%、阳性预测值为91.30%、阴性预测值为68.75%。血浆cfDNA的KRAS突变率为28.17%，组织DNA的KRAS突变率为43.66%，两种标本的KRAS突变检测的一致率为78.87%。血浆cfDNA与组织DNA的KRAS突变检测结果一致（Kappa=0.553，P=0.000，表 2）。血浆cfDNA KRAS检测的敏感性为58.06%、特异性为95.00%、阳性预测值为90.00%、阴性预测值为74.5%。血浆标本及组织标本的RAS检测突变类型分析结果见表 3。

表 1(Table 1)

表 1 血浆标本与相应组织标本的RAS突变一致性检测结果 Table 1 Comparison of RAS mutation in plasma circulating cell-free DNA (cfDNA) and matched tumor tissue DNA RAS status in plasma cfDNA RAS status in tumor tissue DNA Kappa P Mutated Wild type Total Mutated 21 2 23 0.523 0.000 Wild type 15 33 48 Total 36 35 71

表 1 血浆标本与相应组织标本的RAS突变一致性检测结果 Table 1 Comparison of RAS mutation in plasma circulating cell-free DNA (cfDNA) and matched tumor tissue DNA

表 2(Table 2)

表 2 血浆标本与相应组织标本的KRAS突变一致性检测结果 Table 2 Comparison of KRAS mutation in plasma and matched tumor tissue DNA KRAS status in plasma cfDNA KRAS status in tumor tissue DNA Kappa P Mutated Wild type Total Mutated 18 2 20 0.553 0.000 Wild type 13 38 51 Total 31 40 71

表 2 血浆标本与相应组织标本的KRAS突变一致性检测结果 Table 2 Comparison of KRAS mutation in plasma and matched tumor tissue DNA

表 3(Table 3)

表 3 血浆与组织标本的RAS检测突变类型结果 Table 3 RAS mutation types in plasma cfDNA and tumor tissue DNA (n=71) Plasma Tumor tissue n Mutation rate (%) n Mutation rate (%) KRAS 20 28.17 31 43.66 NRAS 3 4.23 5 7.04 KRAS exon 2 18 25.35 27 38.03 KRAS exon 3, 4 and NRAS exon 2, 3, 4 5 7.04 9 12.68 Extend RAS# 23 32.39 36 50.70 #Extend RAS test detected hotspot mutations in KRAS exon 2, 3, 4 and NRAS exon 2, 3, 4.

表 3 血浆与组织标本的RAS检测突变类型结果 Table 3 RAS mutation types in plasma cfDNA and tumor tissue DNA (n=71)

血浆cfDNA的RAS突变状态与结直肠癌患者年龄、性别、分期（Ⅳa与Ⅳb）、原发肿瘤部位（左半结肠与右半结肠）、肺转移、CEA水平、CA199水平等无明显相关性，而血浆cfDNA的RAS突变与结直肠癌患者肝脏转移有相关性（P=0.045），肝转移患者较未发生肝转移的患者突变率升高（表 4）。

表 4(Table 4)

表 4 血浆RAS突变状态与患者临床特征关系 Table 4 Clinical features and RAS mutations in plasma (n=71) Clinical feature n RAS mutation P The number of mutation Mutation rate (%) Age of blood collection (year) 0.072   < 65 40 9 22.50  ≥65 31 14 45.16 Gender 0.320  Male 40 15 37.50  Female 31 8 25.81 Locus tumor site 0.324  Left hemicolon 27 9 33.33  Right hemicolon 21 9 42.86  Rectum 23 5 21.74 Stage# 0.450  Ⅳa 34 13 38.24  Ⅳb 35 10 28.57 Liver metastasis 0.045  Yes 40 17 42.50  No 31 6 19.35 Lung metastasis  Yes 21 5 23.81 0.237  No 50 18 36.00 CEA 0.284  Normal 26 10 38.46  High 45 13 28.89 CA199 0.427  Normal 48 14 29.17  High 23 9 39.13 #The 71 patients, included 1 patient in stage Ⅱ, 1 patient in stage Ⅲ, 34 patients in stage Ⅳa, and 35 patients in stage Ⅳb. Stage Ⅱ and Ⅲ were not analyzed because of the small sample size.

表 4 血浆RAS突变状态与患者临床特征关系 Table 4 Clinical features and RAS mutations in plasma (n=71)

西妥昔单抗或帕尼单抗可与CRC细胞表面的EGFR特异性结合，抑制EGFR与其配体结合，从而阻断EGFR信号转导途径，导致肿瘤细胞增殖受到抑制，凋亡增加^[10]。RAS基因突变后能自动地活化EGFR下游通路，持续地为肿瘤细胞生长提供信号，最终促使肿瘤细胞对抗EGFR单抗治疗无效，细胞不断异常增殖侵袭，威胁患者生命^[10]。KRAS外显子2基因突变可预测mCRC患者对抗EGFR单抗治疗无效^[4-5]。近年研究发现^{[2-3, 10, 12]}，扩展RAS检测，即考虑所有与mCRC抗EGFR单抗靶向药物疗效预测相关的RAS热点突变（存在于KRAS基因第2、3、4外显子和NRAS基因第2、3、4外显子）后，可以发现更多不能从抗EGFR单抗靶向药物获益的人群，从而使治疗更为精准。本研究试剂盒所检测的RAS基因突变属KRAS和NRAS基因第2、3、4外显子的热点突变。目前的证据显示^[10-11]，若mCRC患者携带本研究试剂盒所涉及的任一RAS基因突变，均提示该患者对西妥昔单抗或帕尼单抗治疗无效。PRIME试验中报道的KRAS外显子2的突变发生率约为40%，KRAS基因第3、4外显子和NRAS基因第2、3、4外显子发生率约占17%。周政等^[13]采用RE-PCR法检测KRAS外显子2突变，组织样本突变率为15.57%，血浆KRAS突变率为16.00%，本研究的组织样本KRAS外显子2的突变率为38.02%，血浆样本KRAS外显子2的突变率为25.35%，较该报道突变率有提高。本研究增加检测NRAS和除外显子2的KRAS后（扩展的RAS检测），组织样本RAS的突变率为50.7%，血浆样本RAS突变率为32.39%。因此，我们的研究显示，无论组织样本还是血浆样本，扩展RAS检测均能进一步提高RAS热点突变位点的检出率，更好地筛选出对抗EGFR单克隆抗体分子靶向药物耐药的人群，减少不必要的医疗支出，为患者接受其他有效治疗赢得时机。

目前大多数CRC分子诊断和研究是在手术或活检获得肿瘤组织的基础上进行的。然而，利用肿瘤组织进行基因检测也面临许多困境。首先，mCRC的肿瘤组织获取率低，许多mCRC患者难以在治疗前或治疗中获取足够质与量的肿瘤组织用于基因检测^[9]；第二，结直肠癌原发灶与转移灶的基因突变状态存在不一致性，即使同一肿瘤组织样本也存在基因异质性^[6-8]；第三，手术或活检是侵入性的操作，难以再次或反复进行。大部分患者初诊时获取的组织标本并不能实时反映肿瘤生物学状态。在药物、环境等外部因素以及肿瘤本身异质性的内部因素下，肿瘤基因组很可能处于不断的变化之中，以某个时间点肿瘤组织的基因状态来指导患者在其他时间点的治疗决策是不合适的。这些问题使得临床工作中无法及时和准确地获得患者的基因突变信息，从而缩小了抗EGFR单克隆抗体的适用人群，降低了mCRC的诊治水平。因此，亟需研究肿瘤组织以外的样本，如血液样本，进行CRC的基因分析。

近年来，随着高灵敏度检测技术的进展，液体活检（利用血液样本检测那些组织样本检测的指标）技术的研发越来越迅速并受到重视和认可。cfDNA在健康个体中水平很低，而在肿瘤患者中明显升高。肿瘤衍生的cfDNA的特异性检测已被证明与肿瘤负荷相关，能指示耐药细胞亚群在治疗反应过程中的扩散，患者对治疗或手术响应时cfDNA能发生变化^[14-16]。肿瘤患者的cfDNA所含有的循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）成分的来源主要有三种假说^[14]：凋亡和坏死的肿瘤细胞未被机体吞噬细胞有效清除，导致细胞碎片（包括DNA）累积，然后被释放到血液中；肿瘤细胞主动释放DNA进入血循环；由血液中的循环肿瘤细胞释放。与肿瘤组织来源的DNA相比，使用血液来源的cfDNA样本进行CRC分子检测更具应用潜力和市场优势。首先，采集肿瘤患者血液再分离cfDNA是非侵入性的方法，获取方便，可以根据临床需要在恰当的时间点采集样本；其次，cfDNA样本提供的基因数据是系统的综合性的遗传信息（包括原发灶和转移灶），反复采血还可以动态跟踪肿瘤基因组进化^[14]，有效减少了由于肿瘤组织空间上和时间上的异质性导致的基因检测结果的偏差。我国2014年已有针对肺癌患者的血液（血浆cfDNA）EGFR突变检测试剂盒获批上市。鉴于肺癌血液EGFR突变检测技术的日趋成熟，2014年欧洲药品管理局（EMA）已建议批准采用血液ctDNA检测方法评估EGFR突变状态，进而鉴别出可能从靶向药物易瑞沙治疗中受益的非小细胞肺癌患者群体。在CRC研究领域，cfDNA水平被发现与CRC疾病分期和术后复发相关^[17-19]。目前为止，cfDNA扩展RAS突变分析与疾病临床特征、预后和靶向药物疗效预测关系的研究数据尚少。已有少量文献报道，在接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗期间，血液中KRAS基因突变检测可能比常规方法提前检测到抗性等位基因^[20-21]。Diaz等^[20]对24例结直肠癌患者血液进行监测，9例采用等位基因法检测KRAS基因突变，3例患者多个KRAS突变，可能是从不同的子系产生。文献报道的血液标本与组织标本对比的KRAS突变检测敏感性约32%~100%，特异性约70% ~100%，一致率约69%~90% ^[22-25]。本研究发现，血液标本与组织标本对比的KRAS突变检测敏感性约58.06%，特异性约95.00%，一致率约78.87%，符合文献报道。本研究进一步发现，CRC组织样本DNA和血浆的cfDNA样本检测RAS基因突变的一致性较好（Kappa=0.523，P=0.000），血浆cfDNA检测RAS基因的敏感性为58.33%、特异性为94.29%、阳性预测值为91.30%、阴性预测值为68.75%，故提示临床实践中在无法利用组织标本的情况下，血浆cfDNA可作为替代标本应用于临床RAS突变人群的筛选。RAS基因状态与临床特征关系的研究甚少。周政等^[14]研究发现KRAS突变与肿瘤的部位（结肠、直肠、弥散分布）、分化程度、病理分期、有无淋巴结转移、年龄无明显关系。本研究发现，血浆cfDNA的RAS突变状态与CRC患者年龄、性别、分期（Ⅳa与Ⅳb）、原发肿瘤部位（左半结肠、右半结肠、直肠）、肺转移、CEA水平、CA199水平等无明显相关性，而CRC肝转移的患者较未发生肝转移的患者突变率升高（P=0.045），提示有肝转移的患者血浆cfDNA的RAS突变检测临床应用价值更高。

总之，血浆可以作为无法获得组织标本的CRC患者的RAS基因检测的替代标本，尤其是CRC伴肝转移的患者，具有临床应用价值。本研究可进一步扩大实验样本量验证研究结果，并有进一步开展血浆RAS检测结果预测抗EGFR单抗临床疗效研究的价值。