枯萎卵又叫空孕囊，指妊娠6~13周宫内有孕囊但未见胎芽结构^[1]，是稽留流产的一种常见类型。枯萎卵的发生率尚无确切报道，在自然流产中占15%~40% ^[1-2]，近期有1篇文献枯萎卵在辅助生殖技术(ART)的早期自然流产中占43.5% ^[3]。关于枯萎卵的病因学研究十分有限，胚胎染色体异常是目前公认的因素^[4]。另外，也有学者认为血清铅浓度升高、叶酸和某些矿物质缺乏等和枯萎卵的发生相关^[5-6]。通常ART人群在备孕期间戒烟、戒酒、作息规律，有意规避了部分体内外环境影响，并积极补充叶酸和维生素矿物质，但据本研究初步统计枯萎卵的发生率并不比自然妊娠低。目前国内外都将有胎芽无胎芽的流产混合进行研究^[7-8]，关于ART中枯萎卵发生的相关因素尚未见确切报道，本文旨在为阐明枯萎卵的发生机制奠定基础，为评估辅助生殖技术的安全性提供理论依据。

回顾性收集2012年1月~2015年12月在南方医院生殖中心行体外受精-胚胎移植临床妊娠的周期，包括早期胚胎停育440例和同期单胎活产1938例，停育分为枯萎卵147例和胎芽停育293例。纳入标准：B超显示宫内单胎妊娠；停育发生在孕12周内；足月分娩(满37周至不满42周)，正常体质量儿(2500~4000 g)。排除标准：异位妊娠、宫内合并宫外孕；双胎及以上妊娠；中晚期流产、死产、死胎、畸形引产；早产、过期产；低体质量儿、巨大儿、出生缺陷；母体子宫解剖异如先天畸形、巨大子宫肌瘤或腺肌瘤导致的宫腔占位，免疫异常如ANA (+)、ACA (+)；NC-OPU、供卵、供精、冻卵、冻精；资料不全。

枯萎卵组：移植后4周阴道超声宫腔内只有孕囊未见胎芽或仅见点状胎芽，1周后复查仍未见明显胎芽，147例；胎芽停育组：阴道超声提示孕囊内显示胚胎，但未见胎心或胎心出现后消失，293例；活产组：1938例。

控制性超促排卵(COH)采用常规促排卵方案，根据患者的年龄、基础卵巢激素及窦卵泡数使用促性腺激素促排卵，B超监测到2个卵泡直径≥18 mm或3个卵泡直径≥17 mm，当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)(丽珠制药，5000~10 000 U)，34~36 h后行B超引导下穿刺取卵术，获得的卵子经体外受精或卵胞质内单精子显微注射(IVF/ICSI)授精。男方取精前禁欲3~7 d，取卵日手淫方式留取精液标本，采用密度梯度离心法处理精液，对于梗阻性无精症患者，取卵当日行经皮附睾穿刺取精或经皮睾丸穿刺取精(PESA /TESA)。IVF或ICSI后第1天观察卵子受精情况，双原核(2PN)卵子作为正常受精卵。第3天时观察胚胎的发育情况后根据Peter分级标准记录胚胎的分级及卵裂球数。囊胚培养则将胚胎移入预先平衡好的G2培养液微滴中，于37 ℃、CO₂体积分数为5%的培养箱中继续培养，第5天观察囊胚并依据Gardner评分标准评分。

新鲜周期组：自取卵日黄体支持，受精后48~72 h行胚胎移植，移植10~14 d后验血清β-hCG，移植后4周行阴道B超显示孕囊者确定为临床妊娠。冷冻周期组：本中心常规玻璃化冷冻，内膜准备后黄体支持3~5 d行移植冻融胚胎，移植10~14 d后验血清β-hCG，移植后4周行阴道B超显示孕囊者确定为临床妊娠。

卵裂期胚胎：受精后胚胎开始卵裂，直至囊胚前期。囊胚期胚胎：体外培养第5~7天，分裂球形成中空的球状胚，称为囊胚，分为1~6期。

正常受精且受精48或72 h后卵裂球数目4~5个或7~8个的Ⅰ级及Ⅱ级胚胎；体外培养5~6 d后囊胚评级3期以上，内细胞团(ICM)和滋养外胚层细胞(TE)评分为A级或B级定义为优质囊胚；另外，把移植Day4胚胎发育至16细胞水平以上的也定义为优质胚胎。

比较3组一般临床特征，包括女方年龄、男方年龄、基础窦卵泡数(AFC)、基础卵泡刺激素(bFSH)、bFSH/ bLH不孕年限、Gn用量、Gn天数、hCG日雌二醇、移植日内膜厚度、获卵数、移植优质胚胎率、β-hCG检测日和血清β-hCG值、不孕类型、流产次数；比较不同移植周期、胚胎类型、不孕因素和受精方式间枯萎卵的发生率。

采用SPSS 20.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，均值比较采用单因素方差分析，组内多重比较方差齐性选择LSD法，方差不齐选择Dunnett's T₃法；计数资料以百分比(%)表示，率的比较采用R*Cχ²检验；将P＜0.05的影响因素全部纳入多分类Logistic回归，以活产组为参照，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3组患者一般临床特征比较，双方年龄、不孕年限在枯萎卵和胎芽组显著高于活产组(P=0.000，P= 0.005)；枯萎卵组BMI显著高于活产组(P=0.003)，但和胎芽组无统计学差异；胎芽组Gn用量显著高于其余两组(P=0.000)；已知验孕时间波动在10~14 d，β-hCG值随着时间推移呈上升趋势，3组验孕时间无差异(P= 0.264)，组间两两比较β-hCG值有统计学差异，枯萎卵组＜胎芽停育组＜活产组(P=0.000)；枯萎卵和胎芽组的不孕类型和流产次数和活产组有显著性差异(P=0.000，P=0.012)，3组间其他参数无统计学差异(P＞0.05，表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 3组患者临床特征比较 Table 1 Comparison of clinical data of the patients among the 3 groups (Mean±SD, %) Variable Anembryonic（n=147） Embryonic（n=293） Live birth（n=1938） P Maternal age 33.57±4.53a 33.46±5.05a 31.12±4.14b 0.000* Paternal age 35.78±4.95a 35.73±5.44a 33.81±5.16b 0.000* BMI 21.93±3.08a 21.53±2.77a, b 21.21±2.70b 0.003* AFC 14.33±7.26 14.94±7.89 15.7±7.64 0.056 Basal FSH 6.63±1.83 6.80±2.38 6.77±2.16 0.738 bFSH/bLH 1.59±0.99 1.52±0.77 1.56±0.89 0.689 Duration of infertility 5.00±3.55a 5.00±4.00a 4.46±3.01b 0.005* Gn dosage 2413.50±971.89a 2622.96±1170.44b 2286.95±959.44a 0.000* Gn days 10.20±1.97 10.72±2.71 10.46±2.38 0.081 E2 on HCG day 2926.40±1767.11 2853.18±1776.17 2886.62±1615.83 0.902 Endometrial thickness 1.04±0.22 1.05±0.19 1.05±0.21 0.629 Retrieved oocyte number 13.19±7.20 12.68±7.21 13.37±6.98 0.281 High-grade embryo rate 0.785 0.78 0.787 0.942 β-HCG testing day 11.32±1.06 11.28±0.97 11.21±0.895 0.264 Serum β-HCG 187.99±183.21a 240.34±188.10b 306.93±238.56c 0.000* Infertility type  Primary 35.4%a 36.5%a 48.9%b 0.000*  Secondary 64.6%a 63.5%a 51.1%b 0.012* Miscarriage times  One 80.3%a 78.8%a 88.1%b  Two 18.4%a 17.1%a 9.0%b  Three 1.4%a 4.1%a 2.9%a One-way ANOVE and chi-squared tests, with *P＜0.05 considered statistically significant. Subscript a, b or c mean different with multiple comparison.

表 1 3组患者临床特征比较 Table 1 Comparison of clinical data of the patients among the 3 groups (Mean±SD, %)

本中心极少新鲜周期移植囊胚，因此单独分析卵裂期胚胎不同移植周期和冷冻周期移植不同胚胎枯萎卵的发生率，结果显示卵裂期胚胎新鲜和冷冻移植枯萎卵的发生率无统计学差异(P=0.667)；在冷冻移植中，囊胚移植的枯萎卵发生率显著高于卵裂期胚胎(11.6% vs 5.6%，P=0.000)；不孕因素和受精方式间枯萎卵的发生率无统计学差异(P=0.102，P=0.745，表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 不同移植周期、胚胎类型、不孕因素和受精方式间枯萎卵发生率的比较 Table 2 Comparison of incidences of blighted ovum in cases with different cycles, embryo stage, infertile factors and method of fertilization (%) Outcome Cleavage stage (%) Frozen-thawed cycle (%) Infertility factors (%) Fertilization (%) Fresh Frozen Cleavage Blastocyst Paternal Maternal oBoth IVF ICSI Blighted ovum 5.0 5.6 5.6 11.6 4.6 5.7 7.5 4.9 6.0 Embryonic 11.9 10.8 10.8 17.0 10.6 13.6 12.0 11.8 10.9 Live birth 83.1 73.5 83.5 71.4 84.8 80.7 80.5 83.3 83.0 χ2 0.810 21.819 7.733 0.589 P 0.667 0.000 0.102 0.745

表 2 不同移植周期、胚胎类型、不孕因素和受精方式间枯萎卵发生率的比较 Table 2 Comparison of incidences of blighted ovum in cases with different cycles, embryo stage, infertile factors and method of fertilization (%)

纳入单因素分析中有差异的因素，包括双方年龄、BMI、不孕年限、复发性流产、Gn用量、血清β-hCG值、不孕类型和胚胎类型，作logistic回归分析。经多因素模型检验，女方年龄、β-hCG是枯萎卵发生的危险因素；校正年龄等混杂因素后，囊胚移植也是枯萎卵发生的危险因素(OR=4.051，表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 枯萎卵logistic回归多因素分析 Table 3 Logistic regression analysis of the risk factors of blighted ovum B S.E. Wald P Exp (B) 95% CI. for Exp (B) Lower Upper Maternal age 0.131 0.034 14.870 0.000 1.141 1.067 1.219 Serum β-HCG -0.004 0.001 31.776 0.000 0.996 0.994 0.997 Blastocyst -1.399 0.242 33.506 0.000 4.051 2.523 6.506

表 3 枯萎卵logistic回归多因素分析 Table 3 Logistic regression analysis of the risk factors of blighted ovum

本研究2378例ART样本中，枯萎卵占早期流产的33.4%，囊胚移植中为40.2%，呈升高趋势，但均低于前文报道的43.5% ^[3]。囊胚增加枯萎卵的发生风险(OR= 4.051)，那么枯萎卵发生率可能和该中心的囊胚移植率有关。在单因素分析中，男方年龄、女方年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、流产次数、β-HCG和囊胚移植都和枯萎卵的发生相关。女方高龄是早期自然流产的独立危险因素，具体机制不明，≥35岁妇女胚胎绒毛染色体非整倍体率高达50% ^[9]。男方年龄在ART中的影响虽不如女方显著，但超过40岁精子DNA碎片和胚胎非整倍体率也升高^[10]。超重或肥胖(BMI≥25 kg/m²)不增加非整倍体的发生率^[9]，但会改变表观遗传修饰作用影响基因的表达^[11]。流产组女性年龄升高，子宫内膜容受性下降，不孕年限变长^[12]；有研究表明既往自然流产会增加再次流产的机会，导致自然流产的因素可能也和枯萎卵的发生相关^[13]，所以枯萎卵和胎芽组都是以继发性不孕为主，流产次数多于活产组。

在确认宫内早孕后，血清β-HCG越低，枯萎卵的发生风险越高。早孕期血清β-HCG的水平是由绒毛合体滋养层细胞的数量和发育状态决定，胚胎的生长和滋养层的发育起着相互促进的作用^[14]。枯萎卵的超声征象囊壁薄，大多数无卵黄囊，曾有学者对其妊娠囊观察，囊外缺乏绒毛组织，病理切片中绒毛细胞稀少^[15]，这可能是枯萎卵的血清β-HCG水平显著低于其他妊娠的主要原因。在6~8周的枯萎卵中发现β-HCG、妊娠相关血浆蛋白(PAPP-A)、妊娠蛋白1 (SP-1)、雌二醇和孕酮均低于正常妊娠，且除PAPP-A外，其余4项也低于有胎芽的流产类型^[14]，和本研究结果一致。但Agudelo等^[16]认为枯萎卵β-HCG并不比胎芽妊娠低，因为β-HCG在核型异常的早期流产中显著高于正常核型，而枯萎卵以异常核型为主，缺点是此研究仅纳入了11例样本。临床大力倡导囊胚移植的优点，但最近一项Mate分析显示，囊胚移植并未明显提高临床妊娠率、活产率或降低流产率，相反延长体外培养可能对胚胎造成潜在的损伤，增加额外的损耗^[17]。滋养细胞比内细胞团对环境更加敏感，动物实验表明体外培养过程中不适的营养成分、温度、氧分压和PH值使胚胎长时间处于应激状态，会干扰DNA甲基化过程^[18]。对小鼠体内和体外形成的囊胚进行比较，体外组的胚胎头臀长和胎盘更小，妊娠丢失率增加，同时检测到胎盘中H19、KvDMR1、Snrpn基因的甲基化水平显著下降^[19]。囊胚培养可有效降低胚胎的非整倍体率，但增加枯萎卵的发生风险，推测枯萎卵可能和染色体异常关系不大，不排除和DNA甲基化异常有关。

关于枯萎卵的染色体异常率报道不一，既往有2项研究认为枯萎卵和胎芽停育的核型一致，染色体异常率高^{[4, 20]}；但近3年的3篇文献报道枯萎卵的染色体异常率是显著低于胎芽停育的^{[3, 21-22]}。特别是Ouyang等^[3]大样本回顾性研究，研究对象及纳入排除标准和本文相近，得到枯萎卵的染色体异常率仅为37.5%。近年来关于基因印记和流产的关系已有报道，主要通过影响滋养层来阻碍胚胎的生长发育^[23]。枯萎卵的β-HCG水平下降和绒毛血管生成缺陷就是滋养层功能不良的表现^[24]。枯萎卵是一种早期胚胎宫内生长受限，吴爱华根据胎芽情况将早期稽留流产分为发育正常、发育偏慢和空囊型3组，发现空囊型中5-mC含量最低，且5-mC含量与核型正常与否无关^[25]。5-mC是DNA甲基化的标志性产物，而DNA甲基化又是基因印记的主要形式，5-mC含量下降意味着枯萎卵很可能和印记丢失有关。在自然界有一种核型的流产和枯萎卵的表型极为相似：三倍体Ⅰ型。三倍体Ⅰ型包含两个母源性染色体组和一个父源性染色体组，表现为胎盘小且非囊性，胎儿极度发育不全^[26]。根据表观遗传学理论，母源性基因高表达限制了胚胎生长，是造成这种表型的重要机制。结合以上原因，有理由认为枯萎卵可能是母系印记丢失、基因表达失衡的结果。

综上所述，在ART中女方年龄增大、β-HCG值降低和囊胚移植会增加枯萎卵的发生风险，胚胎冻融、单精子卵胞浆注射、Gn用量以及胚胎质量等对枯萎卵的发生影响不大。李秋芬认为枯萎卵的发生还和胚胎质量相关^[27]，但其样本量太小，本研究未得出此结论。辅助生殖技术的安全性问题一直是讨论的热点，近十几年来较多学者认为ART可能影响表观遗传的调控，特别是印记基因的表达。配子形成和胚胎发育早期是表观遗传印记擦除和重建的重要阶段，ART的任何环节均有可能干扰印记的建立，从而影响胚胎植入、胎盘形成和胚胎生长等^{[19, 28-30]}。枯萎卵的发生和囊胚培养密切相关，还需进一步基础实验来阐明机制。另外，在临床工作中要不断改进实验室技术，优化培养条件，设立严格的指征，尽可能减少额外的体外培养。