核仁素(nucleolin，又称C23) 是目前发现的271种核仁蛋白质中含量最多的一种，约占核仁蛋白质总量的10%。核仁素是一种穿梭蛋白，也是一种DNA/RNA结合蛋白，在不同类型的细胞，它可能存在于不同部位^[1-4]。核仁素有广泛的生物学功能，据文献报道^[5-11]，Nucleolin可调控核糖体的生物合成与成熟，调控细胞增殖、生长、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生，促进细胞增殖，抗细胞凋亡，影响病毒复制及协助病原体侵袭等，核仁素还作为一种穿梭蛋白和细胞表面受体，参与细胞核与细胞浆之间的物质转运以及细胞核功能的细胞外调节^[12-13]。

有研究显示^[14]，Nucleolin可调控胚胎干细胞的增殖、分化与凋亡。神经干细胞(NSCs)和胚胎干细胞一样，具有自我更新和多向分化潜能。那么核仁素对NSCs的作用是否和胚胎干细胞一样，能影响其增殖、分化、凋亡，关于这方面的研究目前未见文献报道。本研究构建针对大鼠nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体，将其转导入大鼠NSCs中，沉默其nucleolin基因的表达，了解nucleolin对NSCs分化的影响并初步探讨其机制。

实验用新生1~3 d的Sprague-Dawley大鼠，由广东省医学实验动物中心提供。

RNA提取试剂TRIzol购自Invotrigen；M-MLV反转录酶购自Promega；Phusion、Q5 DNA聚合酶、T₄ DNA Ligase、限制性内切酶购自NEB；DNA相对分子质量Marker购自TaKaRa；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒购自天根公司；质粒大提试剂盒购自Qiagen；大肠杆菌DH5a、DH12S感受态细胞由本实验室保存；小鼠C23单克隆抗体、兔Wnt3多克隆抗体购自Santa Cruz；PCNA抗体购自BD Biosciences；小鼠Nestin抗体、小鼠β-actin抗体、兔β-catenin抗体、兔NSE抗体、兔GFAP抗体购自武汉博士德公司；Cy3标记羊抗兔IgG，FITC标记羊抗兔IgG，HRP标记的羊抗兔IgG，HRP标记的羊抗小鼠IgG，Cy3标记羊抗小鼠IgG均购自武汉博士德公司；DMEM/F12 (1:1) 培养基购自Hyclone；B27、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)购自Gibco BRL；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。

pShuttle质粒、pAdEasy质粒购自溯源精微科技有限公司。

根据GenBank中的nucleolin (Gene ID: 25135，Genbank ID：NM_ 012749.2) 基因序列，设计3个干扰序列，用BLAST比对分析后，未发现有同源序列。并根据干扰序列设计并合成编码shRNA序列的DNA (表 1)，分别命名为shRNAl、shRNA2、shRNA3。用BamHⅠ和HindⅢ酶切pshutlle质粒，回收质粒DNA大片段，将两条模板链退火，退火后1:200稀释，用T₄DNA连接酶将其定向克隆至pshutlle质粒U6启动子后构建成重组质粒。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5a感受态细胞，进行LB抗性单克隆培养。抽提质粒(按照天根质粒提取试剂盒说明书提取)，EcoRⅠ酶切鉴定、DNA序列分析。用PmeⅠ对含有目的片段的pShuttle质粒经进行线性化，回收纯化后与pAdEasy质粒一起共转染BJ5183感受态细胞，用带有卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板进行筛选同源重组的质粒，进行PacⅠ酶切鉴定。

表 1(Table 1)

表 1 shRNA序列 Table 1 siRNA template DNA sequences shRNA Sequence 5'-3' shRNA1-F CCGGGGATGAAGATGAAGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCCTTTTTTG shRNA1-R AATTCAAAAAAGGATGAAGATGAAGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCC shRNA2-F CCGGGGATGAAGATGACAGCGATGACTCGAGTCATCGCTGTCATCTTCATCCTTTTTTG shRNA2-R AATTCAAAAAAGGATGAAGATGACAGCGATGACTCGAGTCATCGCTGTCATCTTCATCC shRNA3-F CCGGGCTCTGTTCGTGCAAGAATAGCTCGAGCTATTCTTGCACGAACAGAGCTTTTTTG shRNA3-R AATTCAAAAAAGCTCTGTTCGTGCAAGAATAGCTCGAGCTATTCTTGCACGAACAGAGC

表 1 shRNA序列 Table 1 siRNA template DNA sequences

重组腺病毒载体经过PacⅠ线性化后，转染HEK293A细胞。转染后每天观察细胞形态，细胞可出现明显的细胞病变(CPE)，观察到90%以上细胞出现CPE现象后，回收细胞进行裂解，收集病毒，即为原代病毒上清。将原代病毒上清按照MOI=10的量加入融合度为95%的HEK293A细胞中，48~72 h后待90%以上细胞出现CPE现象后，收集细胞，进行浓缩纯化处理。病毒扩增后进行的滴度测定。实验前24 h传HEK293A细胞于96孔板中，每孔细胞数约10⁴；将待测病毒用2% FBS-DMEM培养基稀释为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷浓度梯度。稀释完毕后，吸取每个浓度梯度的病毒液100 μL分别加入到检测板中，用同一组无病毒培养基组作为阴性对照。继续培养48 h后观察每孔细胞的CPE情况；以10%以上细胞漂起，90%以上细胞肿胀变圆的孔作为滴度计算孔；估算公式：滴度结果(PFU/ML) = (接种细胞数×稀释度×10) /加入病毒的体积。

取出生3 d内的新生SD大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉处死后，75%乙醇浸泡消毒5 min，分离脑皮质组织，仔细剥除脑膜和表面血管，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃下消化15 min，终止消化并反复吹打制成单细胞悬液，200目筛网过滤，200 g离心5 min，弃上清液后，用DMEM/F12培养基(含20 μL/mL B27，10 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF)重悬，接种至培养瓶，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，每3~4 d半量换液1次，7 d传代1次。

将细胞去除培养液，PBS洗涤2次后，4%多聚甲醛固定40 min，用0.5% Trition X-100处理10 min，2% BSA处理60 min。加入一抗，4 ℃冰箱过夜。去除一抗，加入荧光标记的二抗，湿盒中孵育60 min。去除二抗后，加Hoechst 33258，室温孵育20 min，50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

将蛋白与2×SDS加样缓冲液100 mmol/L Tris-HCl pH6.8，4% SDS，20%甘油，200 mmol/L DTT，0.2%溴酚蓝)混合，100 ℃煮沸5 min。样品经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，经电转移法转移到硝酸纤维素膜上。室温下封闭4 h后，分别加入小鼠C23单克隆抗体(1:1000稀释)，小鼠Nestin抗体(1:100稀释)，兔Wnt3多克隆抗体(1:1000稀释)，兔β-catenin抗体(1:100稀释)，4 ℃过夜，洗膜液洗3次；再加入相应辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG (1:500稀释)，室温孵育1 h后，再次洗膜；随后用DAB显色，扫描到电脑，记录试验结果。同时检测β-Actin或PCNA，作为上样对照。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，以P＜0.05为有差异统计学意义。

原代培养的细胞在无血清的培养基中悬浮生长，48 h后就可以见到大部分细胞死亡，但能见到由2~3个细胞组成的小细胞团，即原代克隆，随着培养时间的增加，细胞团逐渐增大、增多，7 d时生长为数十个至数百个细胞的克隆，呈球形悬浮生长，形态不规则，折光性强，周围可见混杂的其他细胞(图 1A)。原代克隆的形成率在20%~30%之间。传代后出现与原代培养相同的大量次代克隆，并逐渐增大，7 d后可再次传代。连续传代3次后，可见细胞团仍呈悬浮生长，形态规则，折光性强，无突起生长，周围无明显混杂细胞(图 1B)。NSCs在体外传代培养后，已分化成熟的细胞会逐渐贴壁死亡，而NSCs则在培养基中悬浮生长，因此利用传代培养的方法可以纯化所培养的NSCs。

图 1(Figure 1)

图 1 SD大鼠NSCs的体外培养与鉴定 Figure 1 In vitro culture and identification of neural stem cells (NSCs) from SD rats (Original magnification: ×100). A, B: The first and fourth passages of neonatal rat NSCs, respectively; C: Differentiated NSCs; D: Nestin-positive NSCs labeled with CY3 (red); E: NSE-positive NSCs double labeled with CY3 (red) and Hoechst 33258 (blue); F: GFAP-positive NSCs double labeled with FITC (green) and Hoechst 33258 (blue).

将NSCs接种至已用明胶或多聚赖氨酸包被的六孔板中，一部分仍然用含20 μL/mL B27，10 ng/mL bFGF，20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基培养2 h后，行nestin免疫荧光染色；另一部分加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导分化，绝大多数细胞在24 h内会贴壁，并从细胞团的边缘伸出突起(图 1C)。随着培养时间的延长，越来越多的细胞从细胞团中爬行出来，伸出长长的突起，有时会交织成网。

免疫细胞化学发现：NSCs标记蛋白nestin在各级克隆中都有表达(图 1D)；在用10%胎牛血清的DMEM/ F12培养基诱导7 d后，可见神经元细胞的标记物NSE (图 1E)和神经胶质细胞的标记物GFAP (图 1F)在诱导7 d的细胞中表达，而且诱导后的细胞大部分为GFAP阳性的胶质细胞。

经测序证实重组质粒中插入的shRNA片段的碱基序列与设计序列完全一致(图 2)。

图 2(Figure 2)

图 2 测序鉴定3个nucleolin -siRNA表达载体的插入序列 Figure 2 Sequencing results of the inserts of 3 different nucleolin siRNA. A: shRNAl; B: shRNA2; C: shRNA3.

重组腺病毒质粒转染HEK293A细胞，培养5~7 d后出现细胞病变(CPE)，表现为贴壁细胞变圆，肿胀，并逐渐从壁上脱落下来；转染10~12 d后可见圆形细胞呈葡萄串状从集分布于正常的HEK293A细胞上，并出现病毒空斑。由于腺病毒载体携带了GFP报告基因，可用荧光显微镜观察。收集包装成功的病毒裂解液，转导HEK293A细胞可观察到同样的结果(图 3)。

图 3(Figure 3)

图 3 重组腺病毒感染HEK293A细胞 Figure 3 Nucleolin-siRNA recombinant adenovirus transduced in HEK293A cells (× 100). A, C, E, G: HEK293A cells infected by siRNA-or nucleolin-siRNA1-3 recombinant adenovirus (invert contrast microscopy, × 100); B, D, F, H: HEK293A cells infected by siRNA-or nucleolin-siRNA1-3 recombinant adenovirus (fluorescence microscopy, ×100).

将待测病毒稀释为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷浓度梯度，培养48 h后观察每孔细胞的CPE情况；以10%以上细胞漂起，90%以上细胞肿胀变圆的孔作为滴度计算孔；估算公式：滴度结果(PFU/ML) = (接种细胞数×稀释度×10) /加入病毒的体积。本次实验估算的稀释度为10³，得出的病毒滴度为1E+9 PFU/mL。部分结果(图 4)。

图 4(Figure 4)

图 4 不同滴度病毒感染HEK293A细胞的情况 Figure 4 HEK293A cells infected by the recombinant adenovirus at different titers (× 100). A, B, C: Invert contrast microscopy; D, E, F: Fluorescence microscopy.

Western blot分析显示大鼠NSCs分别转染3种重组腺病毒nucleolin-siRNA后，转染nucleolin-siRNA2的细胞nucleolin表达明显受到抑制，Nucleolin-siRNA1和nucleolin-RNA3未见明显的抑制效果(图 5)。

图 5(Figure 5)

图 5 Western blot检测重组腺病毒nucleolin-siRNA对nucleolin表达的影响 Figure 5 Western blot analysis of the expressions of nucleolin and β-actin in NSCs infected with nucleolin-siRNA recombinant adenovirus. A: Western blotting results; B: Quantitative analysis of Western blotting results (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs the other groups. CON: No treatment; siRNA-: siRNA- recombinant adenovirus-infected NSCs; Nucleolin-siRNA1-3: NucleolinsiRNA1-3 recombinant adenovirus-infected NSCs, respectively.

将nucleolin-siRNA2转染NSCs，96 h后提取总蛋白，Western-blot检测nestin蛋白的表达。结果显示，沉默nucleolin后，Nestin的表达明显减少(图 6)。

图 6(Figure 6)

图 6 Western blot检测重组腺病毒nucleolinsiRNA对Nestin表达的影响 Figure 6 Western blot analysis of the expression of Nestin and β-actin in NSCs infected with Nucleolin-siRNA recombinant adenovirus. A: Nestin and β-Actin detected by Western blotting; B: Quantitative analysis of Western blotting results (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs the siRNA- group.

将NSCs分为3组：(1) CON组：未做任何处理；(2) siRNA^-组：siRNA阴性对照腺病毒转染NSCs细胞；(3) siRNA⁺组：Nucleolin-siRNA2腺病毒转染NSCs细胞。将3组细胞在同一时间行免疫荧光染色，分别进行NSE、GFAP染色，显微镜下计数NSCs分化为NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞的百分率。结果发现：siRNA⁺组NSCs分化为NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞的分化率明显比CON组、siRNA-组增加，且差异具有统计学意义(P＜0.01，图 7)。

图 7(Figure 7)

图 7 重组腺病毒nucleolin-siRNA对NSCs的分化的影响 Figure 7 Differentiation of NSCs infected by nucleolin-siRNA recombinant adenovirus (× 100). A: Differentiated NSCs double labeled with CY3 (red) and Hoechst 33258 (blue). siRNA+ promotes NSC differentiation into neurons and astrocytes; B: Differentiation rates of the cells in different groups (Mean±SD, n=6). *P < 0.01 vs CON and siRNA- group.

将nucleolin-siRNA2转染NSCs，96 h后提取总蛋白，Western-blot检测Wnt3蛋白的表达。结果发现：siRNA⁺组Wnt3蛋白的表达明显比siRNA-组增加，且两组之间的差异有统计学意义(P＜0.05，图 8)。

图 8(Figure 8)

图 8 重组腺病毒nucleolin-siRNA对对Wnt3活化的影响 Figure 8 Western blot analysis of the expression of Wnt3 and β-actin in NSCs infected with nucleolin-siRNA recombinant adenovirus. A: Wnt3 and β-actin detected by Western blotting; B: Quantitative analysis (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs siRNA- group.

将nucleolin-siRNA2转染NSCs，96 h后分别提取核蛋白和胞浆蛋白。Western blot检测β-catenin蛋白的表达。结果发现：siRNA⁺组、siRNA^-组β-catenin胞浆蛋白的表达无明显差异，无统计学意义(P＞0.05)；而β-catenin核蛋白的表达则siRNA+组明显比siRNA-组增加，且两组之间的差异有统计学意义(P＜0.05，图 9)。

图 9(Figure 9)

图 9 重组腺病毒nucleolin-siRNA对β-catenin入核的影响 Figure 9 Western blot analysis of the expression of β-catenin, β-actin and PCNA in NSCs infected with nucleolin-siRNA recombinant adenovirus. A: β-catenin, β-actin and PCNA detected by Western blotting; B: Quantitative analysis (Mean±SD, n=3). *P < 0.05 vs siRNA- group.

NSCs是指来源于中枢神经系统的多能干细胞，终身具有自我更新的能力，并能分化成神经系统的各类细胞^[15]。本实验成功地从新生SD大鼠的脑皮质组织中分离培养出了NSCs，通过培养和鉴定，充分说明培养的NSCs具有不断增值和多向分化的潜能，为NSCs在细胞水平的研究奠定了基础。

Nucleolin约占核仁蛋白质总量的10%，主要有3个结构域：N端结构域存在核定位信号，富含酸性残基，含有酪蛋白激酶2和细胞周期蛋白依赖性激酶1的多个磷酸化位点；中央域包含4个RNA识别基序，又称为RNA结合结构域；C-末端富含甘氨酸和精氨酸^{[11, 16-19]}。nucleolin的结构特点赋予其多种配体结合活性，从而发挥了广泛的生物学功能。有研究显示^[14]，Nucleolin可调控胚胎干细胞的增殖与分化，敲除nucleolin可诱导胚胎干细胞分化，且胚胎干细胞的增殖减少，凋亡增加。NSCs和胚胎干细胞一样，具有自我更新和多向分化潜能。那么nucleolin对NSCs的作用是否和胚胎干细胞一样，能影响其增殖、分化、凋亡，我们拟RNA干扰nucleolin，了解nucleolin对神经干细胞转归的影响，寻求nucleolin影响神经干细胞转归的机制。

在本研究中，我们以pShuttle为穿梭载体，采用细菌内同源重组AdEasy系统，通过siRNA技术，成功构建了针对大鼠nucleolin基因的siRNA重组腺病毒载体，包装成腺病毒颗粒后，转染原代神经干细胞，并利用Western blot法筛选出对NSCs有抑制效果的siRNA表达载体。

体外培养的NSCs在经过增殖后去除有丝分裂原，NSCs可出现分化；或者在培养基中添加其他因子，也可以诱导NSCs向其他细胞分化。分化后的细胞可以用针对神经元和星形胶质细胞特异性抗原来鉴定。Nestin，属第Ⅳ类中间丝蛋白，它的表达起始于神经胚形成时，在神经板皮层细胞即开始表达，当神经细胞的迁移基本完成后nestin蛋白的表达量开始下降，并随神经细胞分化的完成而停止表达。一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞(如星形胶质细胞)时，Nestin蛋白便停止表达^[20]。因此nestin中间丝蛋白，系早期原始神经细胞的标志，已被广泛用于NSCs的鉴定。在本实验中我们将nucleolin-siRNA腺病毒表达载体转染至NSCs，Western blot检测Nestin蛋白的表达。结果显示，敲除nucleolin后，Nestin的表达明显减少，证明沉默nucleolin的表达可诱导NSCs的分化。同时我们检测了NSCs分化成神经元和星形胶质细胞的分化率，NSE可以在早期神经前体细胞中表达，一直持续至神经元成熟，GFAP是星形胶质细胞的标记。我们发现沉默nucleolin的表达后，NSCs分化成神经元和星形胶质细胞的分化率明显比对照组增加，近一步说明沉默nucleolin的表达可诱导NSCs的分化。那么nucleolin影响NSCs分化的机制是什么呢？研究发现胚胎期神经干细胞的发育与BMP、Wnt、Shh等信号系统有密切联系，特别是Wnt信号通路对于神经干细胞发育和分化的精密调节格外受到重视^[21]。Wnt信号转导通路是因其启动蛋白为Wnt蛋白而得名，研究已经发现Wnt信号转导通路与神经发生及干细胞的增殖密切相关^[22-23]。当细胞外信号激活细胞膜上Wnt的受体Frz，在胞外与Wnt结合后，将信号通过跨膜结构作用于胞质内的Dsh，Dsh能阻断β-catenin降解复合体的形成，切断β-catenin的降解途径，使细胞质内的β-catenin增多，增多的β-catenin进入细胞核，与LEF/TCF结合，特异性的启动激活下游靶基因的转录^[24-25]。那么nucleolin影响NSCs的分化是否也是通过Wnt信号通路起作用的呢？Wnt3蛋白是Wnt信号通路的起始蛋白，Wnt3蛋白的表达增加可激活Wnt信号通路^[26]。基于这一研究思路，我们提取了总蛋白检测Wnt3蛋白的表达。结果发现，沉默nucleolin能诱导Wnt3蛋白的表达。为了近一步验证沉默nucleolin可以启动Wnt信号转导通路，我们提取了胞浆蛋白及核蛋白，分别检测β-catenin的表达。结果发现，沉默nucleolin，β-catenin核蛋白的表达明显增加，而胞浆蛋白的表达无变化。β-catenin向细胞核内转移是Wnt途径活化的标志^[27]，这就是说细胞受到了刺激，细胞外信号激活细胞膜上Wnt的受体Frz，β-catenin进入细胞核，Wnt信号转导通路被激活，特异性的启动激活下游靶基因的转录，促使NSCs向神经元和胶质细胞分化。我们从中可以得出，nucleolin影响NSCs分化的机制可能与Wnt信号转导通路的激活有关。