RhD血型是肾移植术前的必备检测项目，我国肾移植中RhD血型的确定一直以来都沿袭传统的血清学检测，RhD变异体对临床肾移植的影响正逐渐引起人们的重视。国际输血协会（ISBT）确认的29个红细胞血型系统中最具多态性和复杂性的血型系统即是Rh血型系统，Rh血型系统在临床中的重要性仅次于ABO血型系统^[1-3]。RHD是Rh血型系统中最为重要的血型基因。根据红细胞表面是否含有D抗原将Rh血型分为Rh阳性和Rh阴性。研究报道，中国人群中D抗原阴性率为4‰，而这4‰包括弱D（weak D）、部分D（partial D）、放散D（D-elution）和真实RhD阴性^[4]。因此，2012年1月1日起，欧美日均已实行对所有RhD血清学阴性的供受者进行RHD基因检测^[5-6]。在临床肾移植中，非精准的RhD血型检测会导致RhD变异体的患者丧失肾脏移植替代治疗的机会；RhD变异体的供者移植给RhD真阴性的患者后可能发生不明原因的排斥反应、移植肾功能恢复延迟（DGF）、移植物存活时间缩短等不良愈后。目前国内各器官移植中心RhD血型的确定基本以血清学检测结果为标准，一旦检测出患者为RhD阴性，RhD阴性供肾稀缺，基本丧失肾移植机会，部分患者在等待合适供肾的过程中因尿毒症各种并发症逝去。其中相当一部分经血清学检测为RhD阴性患者实为RhD阳性变异体，可以接受RhD阳供肾。为此，本研究对经血清学检测为RhD阴性的等候肾移植受者103例血液样本行分子生物学方法（定量PCR-测序技术）检测RHD10个外显子，分析RhD阴性及D抗原变异型（弱D、部分D、放散D），以指导临床肾移植中精准的供受者选择。

采集广州市各器官移植中心2006年1月~2016年1月通过血清学检测为RhD阴性等候肾移植患者103例血液标本；其中男性53例，女性50例，平均年龄39.2岁，彼此间无血缘关系。

静脉血2 mL置EDTA-K2抗凝管。提取红细胞DNA零下80 ℃保存。

微柱凝胶抗人球蛋白卡式技术：强生ORTHO Autovue Innova全自动血型分析系统；IgM型抗-D试剂红细胞；微珠血型卡。

表 1(Table 1)

表 1 RHD等位基因典型变异及其表现型 Table 1 Representative molecular changes in RHD alleles expressing distinct phenotype of the D antigen Classification of antigen variation D antigen phenotype Molecular basis Representative example Protein variation Mechanisms RHD allele Trivial name D negative D negative Lack of protein expression Gene deletion RHD-deletion D negative Noasense mutation RHD(Y330X) Frame shift mutation RIID(488de14) Modifying gene RHAG gene dclelion RhnuU Protein segment exchange on the RBC surface Gene conversion (hybrid protein) RIID-CE(3-7)-D Cde Weak D Quantitative change Amino acid substitution in tlx: membrane or intraccllularly Missense mutation RHD(V270G) Weak D-l Partial D Qualitative change Amino acid substitution on the RBC surface Missense mutation RHD(G335S) DNB DFL Major quantitative change Protein segment exchange on the RBC surface Gene conversion (hybrid protein) RHD-CE (3-6)-D DVI-3 Grossly reduced translation or protein expression Missense mutation RHD(M2951) in CDe Mutation at splicesite RHD(K409K)

表 1 RHD等位基因典型变异及其表现型 Table 1 Representative molecular changes in RHD alleles expressing distinct phenotype of the D antigen

RHD基因外显子1~10的特异性引物和Rhesus hybrid box引物由TaKaRa公司合成。标准质控分别为Dd和dd型标本（批号：S901WP068，德国innotrain）。采用10对序列特异性引物，扩增RHD基因外显子1~10；以人类生长激素（HGH）为对照。该方法分别采用10对外显子引物（表 2）。1.2.6实验步骤PCR分别扩增RHD基因全部10个外显子（Ds1-Ds10），产物经纯化后，分别以各外显子的特异性测序引物采用QPCR定量的方法检测RHD基因的缺失重复及1227点突变，PRC反应总体积50 µL，反应条件同PCR-SSP方法，扩增条件为95 ℃ 20 s、64 ℃ 30 s（扩增第5、7外显子是退火温度改为60 ℃）、68 ℃ 90 s共40个循环，最后延伸5 min。结果用仪器相应软件进行分析和比较。同时采用多重PCR测序和高通量测序的方法，在ION PROTON测序仪上进行序列测定全部的RHD基因突变（不含外显子缺失重复），并将结果与QPCR检测结果整合，作为RHD基因检测的完整解决方案。

表 2(Table 2)

表 2 RHD外显子引物 Table 2 Primers used for RHD exon Primer denotation Previous name Sequence 5'-3' Specificity GenBank Accession number Position Product size (bp) D1-s (=D1-seq) Re01 TCCATAGAGAGGCCAGCACAA D AJ252314 -152 to-132 340 D1-a Ds1a GCTATTTGCTCCTGTGACCACTT D Z97363 +40 to+18 D2-s Ds2s TGACGAGTGAAACTCTATCTCGAT D U66341 -1060 to-1037 1602 D2-a Ds2a GGCATGTCTATTTCTCTCTGTCTAAT D/CE U66341, AB035189 +355 to+330 D2-seq Ds2seq CCTGGATTCCTTGTGATACACG D/CE U66341, U66340 +227 to+206 D3-s rb20d GTCGTCCTGGCTCTCCCTCTCT D AB035190 -29 to-8 219 D3-a Ds3a CTTTTCTCCCAGGTCCCTCCT D/CE AB035192, AB035191 +39 to+19 D3-seq rb21 GGTCCCTCCTCCCAGCAC D/CE AB035192, AB035191 +28 to+11 D4-s Ds4s GCCGACACTCACTGCTCTTAC D/CE U77079, U77078 -36 to-16 378 D4-a Ds4a TGAACCTGCTCTGTGAAGTGC D Y10605 +194 to+174 D4-seq rb22 GGGAGATTTTTTCAGCCAG D/CE Y10605, Y10604 +82 to+64 D5-s rb11 TACCTTTGAATTAAGCACTTCACAG D Y10605 -267 to-243 1458 D5-a rb15 TTATTGGCTACTTGGTGCC D/CE Z97334, AB035197 +1024 to+1006 D5-seq rb24 AGACCTTTGGAGCAGGAGTG D/CE Y10605, Y10604 -53 to-34 D5-s CTGCCAAAGCCTCTACCCG D AJ299023 -502 to-484 984 D5-a (=D5-seq) GCTGACTCTCGCTCATGGT D/CE Z97334 +315 to+297 D6-s (=D6-seq) Ds6s CAGGGTTGCCTTGTTCCCA D/CE Z97334, Z97333 -95 to-97 274 D6-a Ds6a CTTCAGCCAAAGCAGAGGAGG D Z97334 +41 to+21 D7-s re621 TGCCCATCCCCCTTTGGTGGCC D Z97334 -106 to-85 411 D7-a re75 CCAAGGTAGGGGCTGGACAG D AB035194 +171 to+152 D7-seq Ds7seq GTCTCACCTGCCAATCTGCT D/CE Z97334, Z97333 -41 to-22 D8-s Ds8s GGTCAGGAGTTCGAGATCAC D AB035194 -593 to-574 770 D8-a (=D8-seq) GATGGGGCACATAGACATCC D/CE AB035196 +97 to+78 D9-s (=D9-seq) GGTCCAGGAATGACAGGGCT D AB035196 -162 to-143 530 D9-a CGCTGAGGACTGCAGATAGG D AB035185 +294 to+275 D10-s re91 CAAGAGATCAAGCCAAAATCAGT D/CE AB035185, AB035184 -67 to-45 381 D10-a rr4 AGCTTACTGGATGACCACCA D X63097 +290 to+271 D10-seq rr3 CAGTCTGTTGTTTACCAGATGTTGTTAT D X63097 +261 to+234

表 2 RHD外显子引物 Table 2 Primers used for RHD exon

采用SPSS20.0统计软件进行分析，血清学和基因分型对RhD假阴性检出率比较用χ²检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

血清学RhD阴性的103例血样经分子生物学检测，RhD阴性（10个外显子全部缺失）56例（54.5%），RhD假阴性47例（46.5%）。两种方法对RhD阴性识别的差异有显著性（P < 0.05）。

表 3(Table 3)

表 3 RhD假阴性中RhD变异型的比例 Table 3 Comparison of D variant in the RhD false negativity RhD variant Genotype Number % D-elution 33 70.2 Del RhD1227A type 29 88 Del RhD1231A type 1 3 Del RhD1239A type 1 3 Del RhD1241A type 1 3 Del RhD1235A type 1 3 Partial D RhD-CE (2-9)-D type 13 27.7 Weak D Dva (Hus) 1 2.1

表 3 RhD假阴性中RhD变异型的比例 Table 3 Comparison of D variant in the RhD false negativity

D放散型（D-elution）33例（占70.2%），分别为Del RhD1227A型29例，Del RhD1231A型、Del RhD1239A型、Del RhD1241A型、Del RhD1235A型各1例；部分D（partial D）13例（占27.7%）均为RhD-CE（2-9）-D型；弱D（weak D）1例，为Dva（Hus）型。最常见为RhD1227A型和RhD-CE（2-9）-D型。

RHD基因位于1号染色体短臂1p36.11上，长度为57 932 bp，含有10个外显子^[7]。D抗原位于RHD基因编码的D多肽链上，由于没有相应的“d”基因，故无“d”抗原。D抗原的表达有质和量的变化。质的变化主要是指D抗原表位减少，这类人群红细胞也表现为D阳性，但也可能通过输血、妊娠、器官移植方式等产生针对本身红细胞缺失抗原表位的抗-D抗体。抗原量的变化是指抗原数量的多少，而抗原表位正常。D抗原数量正常为1万~3万^[8]。血清学检测的是RHD基因的表现型，分子生物学检测的是RHD基因的基因型，然而RHD基因是在1对同源染色体上的，存在着纯合子和杂合子的可能。在遗传学上，RhD阳性个体可有3种遗传型，第1种类型父源和母源染色体均为RhD阳性；第2种类型1条染色体为RhD阳性，1条为RhD阴性；第3种类型1条染色体为RhD阳性，另1条为RhD变异型。RhD阴性个体，其遗传型只有1种，即2条染色体均为RhD阴性。RhD变异体个体，其遗传型有2种，两条染色体均为RhD变异型；1条染色体为RhD变异体，另1条为RhD阴性。本研究对103例RhD血清学阴性的血标本行基因测序，对RHD基因第1~10外显子序列分析，用分子生物学方法精确地检测出RhD变异型，如弱D（weak D）、部分D（partial D）、放散D（D-elution）。弱D（weak D）产生的原因是RHD基因的点突变即单个核苷酸的突变，其产生的氨基酸改变与细胞膜内或是跨膜区，突变影响到D抗原多肽插入细胞膜，使红细胞D抗原数量减少，但不会影响Rh蛋白的免疫反应性，当输入RhD阳性红细胞时一般不会产生抗-D。在欧洲最常见的弱D1、2、3（weak D1、2、3）占弱D表型97%，这3种类型在欧洲1996年以来，就被欧供体国家强烈推荐为可以接受RhD阳性血液，获得安全输血^[9-11]。但值得注意的是中国常见的弱D 15型却存在抗原位点的缺失，此型别存在抗原位点的缺失，在接受RhD阳性红细胞时理论上会产生针对缺失位点的抗体，国外已有报道弱D15型妇女被免疫产生抗-D ^[12-13]。部分D（partial D）血清学表现为缺失1个或多个D抗原表位，多数部分D表型个体表现为D弱表现性，可以被免疫产生针对所缺失抗原表位的抗体。部分D（partial D）的分子形成机制有3类，分别是RHD/CE融合等位基因（hybrid alleles）、细胞外环的错义突变、散在的错义突变，与弱D不同的是形成部分D（partial D）的氨基酸变异主要位于胞外区域，这也是部分D易产生抗体的原因所在。放散D（D-elution）用常规的血清学方法检测易误判为D抗原阴性，实际这些阴性细胞带有微弱的D抗原，能产生免疫反应^[14-15]。实验结果示，在103例RhD血型初筛阴性患者中，RHD基因完全缺失56例（54.4%），其他47例包含弱D（weak D）、部分D（partial D）和放散D（D-elution）三种类型，假阴性率达45.6%。在RhD假阴性患者中Del RHD1227A型占61.7%，为RhD阴性血型的主要变异型，RhD-CE（2-9）-D型次之，占27.7%，与Stacy A.Scott ^[16]研究结果基本相符合，RHD1227A等位基因在中国汉族RhD阴性人群中比较常见，是1种高频变异体，故称为“亚洲型” ^[17]。

根据Rhesus Base（http://www.rhesusbase.org）记录弱D基因型已有73种，部分D变异体型29种，Del变异型有17种，且不断有新的发现，与传统认为最具临床意义的ABO血型系统相比，表现了RhD血型系统多态性和复杂性。有文献报道^[18]，目前仅对ABO的15种血型基因进行检测。临床中，ABO血型检测的技术要求低，因变异类别种类有限，相合几率高，一旦发生错配其免疫反应所造成的损害远不及RhD。然而目前医疗技术中，绝大多数医院对RhD血型的确定仅简单的行血清学检测。本研究中，在RhD血清学初筛检测为阴性的个体中，有高达45.6%为假阴性（weak D、partial D、D-elution），这必须引起临床医生的高度重视，并行精准的检测，避免不必要的临床风险。RhD变异体中的弱D（weak D）、部分D（partial D）和放散D（D-elution）可以产生抗D抗体，也可以不产生抗体，抗D抗体的产生取决于D抗原的数量，D抗原数量越多D抗体产生越多，反之亦然^[19-20]。这就为RhD假阴性（weak D、partial D、D-elution）的患者在行肾移植前对供受者的选择提供了强有力的理论依据。根据我们研究发现血清RhD阴性中45.6%为部分D（partial D）、弱D（weak D）、放散D（D-elution），实验表明血清学方法并不准确。

对于血清学为阴性而实为部分D（partial D）、弱D（weak D）或放散D（D-elution）RhD假阴性的肾移植供者而言，假如RhD假阴性供肾移植给真正RhD阴性病人，因D抗原的存在，术后可能发生严重的反复性周期性的排斥反应、不明原因的移植肾功能延迟恢复（DGF）、移植物存活时间缩短、感染、慢性移植物抗宿主病^[21]等。对于那一部分为RhD真实阴性的供者，很可能移植给RhD假阴性的受者，而RhD真实阴性的受者得不到适合的供肾，造成RhD真实阴性供肾资源的浪费和不合理分配。大多数移植中心对于RhD阴性供者没有将其作为阴性供者来对待，无形中又降低了真正为阴性受者接受阴性供肾的几率。对于血清学RhD阴性的病人，大多器官移植中心的策略是告知其为RhD阴性难以获得RhD阴性供肾，建议维持血液透析治疗。实际上血清学RhD阴性的受者有45.6%为假阴性，因此这部分病人因RhD血型检测方法的原因而失去肾移植替代治疗的机会，这45.6%的受者中大部分可以接受RhD阳性供肾，获得安全成功的肾移植替代治疗，用分子生物学方法进行RHD基因分型有利于实现精准的肾移植供受体选择，改变目前RhD阴性的受体普遍被放弃肾移植替代治疗的现状。国内虽有极少数跨RhD血型肾移植的个案报道^[22-23]，术后恢复良好，分析其原因可能为RhD血型阴性患者实为部分D（partial D）、弱D（weak D）或放散D（D-elution）的RhD假阴性，其本身就可接受RhD阳性供肾。

综上所述，对于肾移植受者中RhD变异体的个体只要无抗D抗体，均可考虑选择RhD阳性供肾，应当将RhD变异体从血清学为RhD阴性的个体中识别出，因此，有必要将肾移植供受者进行分子生物学RHD基因检测列入肾移植技术规范，更加精准的深入研究RHD基因对于肾移植供受者选择的影响。