2010年全国范围流行病学抽样调查^[1]指出，尽管结核病疫情有了明显下降，但是我国结核病的疾病负担仍很严重。WHO ^[2]曾指出，全球约三分之一的人感染结核分枝杆菌，当中只有10%的人发展为结核病。近些年有研究发现，除环境与生活方式等外界因素^[3-4]外，个体的遗传背景是结核病发生的另一影响因素。目前已经发现多个基因位点^[5-8]与结核病发病密切相关，其中维生素D受体（VDR）是其中主要的候选基因之一^[9-10]。人类的VDR基因位于第12条染色体长臂上，该基因存在数个多态性位点，主要包括ApaⅠ、BsmⅠ、FokⅠ、TaqⅠ位点。其位于12号染色体3'转录起始部位的Ⅷ号内含子，参与基因表达的调控，并能被ApaⅠ限制性内切酶识别并酶切，呈现多态性。迄今有关VDR基因ApaⅠ酶切位点多态性对于肺结核易感性的研究^[11-12]在国内外已有较多报道，但该位点多态性与骨关节结核易感性是否相关，国内尚未见报道。本研究意在探讨我国广东地区汉族人群中骨关节结核的发病是否与ApaⅠ位点多态性有关，为临床工作中骨关节结核的一级预防和早期诊断提供遗传学理论依据。

选取2015年5月~2016年6月南方医院、广州市胸科医院、广州华侨医院、广州军区总医院、广州中医药大学第一附属医院、河源市中医院收治的骨关节结核患者100例，其中63例男性，37例女性；发病年龄5~84岁，平均46.3岁。

纳入标准：广东地区汉族人；术前血液感染指标及影像学资料符合骨关节结核，术后病灶病理切片证实结核病感染征象的患者，纳入病例组。

排除标准：合并肺结核或HIV患者；长期应用激素、自身免疫性疾病、未进行卡介苗接种、肝肾功能异常、糖尿病、过量饮酒、吸烟。

选取2015年10月~2016年6月河源市中医院体检体中心的健康查体者100例，其中53例男性，47例女性；年龄22~76岁，平均40.4岁。

纳入标准：广东地区汉族人；与病例组患者无血缘关系；经问病查体及胸片检查排除肺结核和骨关节结核病史。

排除标准：有结核病家族史、HIV患者；长期应用激素、自身免疫性疾病、未进行卡介苗接种、肝肾功能异常、糖尿病、过量饮酒、吸烟。

病例组主要通过住院病历获取，对照组通过门诊问诊获取。内容包括一般情况（姓名、性别、年龄）、与结核有关的危险因素（结核接触史、卡介苗接种史）及既往病史（肿瘤、HIV感染、自身免疫性疾病等）。

所有患者在手术前抽取两毫升空腹外周静脉血2 mL，注入EDTA抗凝管内摇匀后存放。使用QIAamp全血基因组DNA快速提取试剂盒（Qiagen公司，瓦伦西亚，CA，美国），按操作说明提取白细胞基因组DNA。随后冻存在-80 ℃。待所有样品收齐后，分批测序。

ApaⅠ:上游引物5'-CAGAGCATGG A-CAGGGAGCAAG-3'、下游引物5-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTCA-3'。反应条件：95 ℃ 4 min预变性、95 ℃ 45 s变性、61 ℃ 40 s退火、72 ℃ 60 s延伸，循环30个，72 ℃ 8 min终末延伸。DNA纯化后加入ApaⅠ限制性内切酶行酶切反应2 h，2.5%琼脂糖凝胶电泳，以扩增片段长度鉴别基因型。

扩增产物经虾碱酶（SAP）（Promega）和外切酶Ⅰ（EXO Ⅰ）（Epicentre）纯化后，用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物经纯化后上ABI3130XL测序仪，最终得到每份样本的基因型。

病例组和对照组一般情况的均衡性比较；ApaⅠ位点基因型分布的遗传平衡性进行确认；通过卡方检验比较两组基因型分布频率的差异，然后对各基因型与骨关节结核发病的关系分别进行单因素分析，计算各自比值比（OR）及95%可信区间（CI），若该区间均大于1则提示该基因型为易感基因型，均小于1提示该基因型为保护基因型。以上两种情况均有统计学意义；若该区间包括1则没有统计学意义。以P < 0.05为差异有统计学意义。

经检验，2组在年龄、性别构成方面的差异无统计学意义（P > 0.05）。

根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律计算对照组各基因型的预期值。经卡方检验各观察值与期望值之间分布近似，P值均 > 0.05，表明对照组样本来自于遗传平衡群体，有较好代表性（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 对照组中ApaⅠ基因型的Hardy-Weinberg平衡检验 Table 1 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test of ApaⅠ genotypes in the control group Genetypes Observed value Expected value AA 33 36.6 Aa 55 47.8 aa 12 15.6 χ2 2.272 P > 0.05

表 1 对照组中ApaⅠ基因型的Hardy-Weinberg平衡检验 Table 1 Hardy-Weinberg genetic equilibrium test of ApaⅠ genotypes in the control group

见表 2。病例组VDR基因型AA、Aa、aa的分布频率分别为51%、41%、8%；对照组VDR基因型AA、Aa、aa的分布频率分别为33%、55%、12%，两组的VDR基因型分布频率有显著性差异（P值 < 0.05）。

表 2(Table 2)

表 2 病例组与对照组ApaⅠ基因型分布频率比较 Table 2 Comparison of ApaⅠ genotype distribution between case group and control group Group n ApaⅠ genetypes AA Aa aa Tuberculosis 100 51② 41① 8① Control 100 33 55 12 ①P > 0.05, ②P < 0.05 vs control group.

表 2 病例组与对照组ApaⅠ基因型分布频率比较 Table 2 Comparison of ApaⅠ genotype distribution between case group and control group

病例组中ApaⅠ-AA基因型的分布频率为51%，显著高于对照组（33%），OR=2.073（χ²=6.742，P < 0.05），95% CI为1.142~3.763。

我国是结核病高负担国家，在2015年全球结核报告中，估算中国结核病患的发病数为98万，占全球的11%，居全球高负担国家的第二位。摒除人口基数大的因素，这是否有人种遗传特征的问题存在？近年来，VDR基因多态性成为了研究的热点，VDR基因位于12号染色体长臂q13-14，其多态性可导致氨基酸序列改变，从而降低转录效率^[14]，最终使核内的VDR不能有效地结合1，25-二羟维生素D3，影响了其协助巨噬细胞抑制结核分枝杆菌胞内生长的作用。许多学者将VDR基因上的多态性作为一些疾病的候选基因进行研究，其中VDR基因多态性对肺结核发病的影响国内外均有较多研究，在不同人群中的研究结果不尽相同^[15-17]。这为本文以中国汉族人群作为样本指明了研究方向。

VDR的基因多态性对骨关节结核易感性影响的研究报道较少。2004年Selvaraj等^[18]通过64例脊柱结核患者和103例健康对照者的VDR基因4个多态性位点进行研究，发现脊柱结核组与健康组的ApaⅠ位点的基因型频率无统计学差异，而结核组的Bb基因型与FF基因型频率显著高于健康组，提示其可能为脊柱结核的易感基因型。2010年Zhang等^[19]通过42例脊柱结核患者和64例志愿者的VDR基因FokⅠ位点多态性进行研究，发现三种基因型FF、Ff、ff在两组间比较有显著性差异（P < 0.05），其中ff基因型在病例组中的分布频率明显高于对照组，OR为3.571（P < 0.05），提示FokⅠ-ff基因型可能是脊柱结核的易感基因型。该结论与Selvaraj等^[18]关于脊柱结核的研究结果不一致，与国内Wu等^[11]关于肺结核的研究结果近似，但3种基因型的分布频率有较大差异。提示人种以及地理位置的差异可能影响脊柱结核的发病，亦提示VDR基因型对肺结核与脊柱结核发病的影响可能不同。

本研究结果与上述Selvaraj等^[18]关于脊柱结核的研究结果亦不一致。本研究发现ApaⅠ基因型在我国汉族人群骨关节结核患者中的分布频率与对照组有统计学差异，且病例组ApaⅠ-AA基因型的分布频率显著高于对照组。以上研究结果的差异，可能原因如下：（1）VDR基因ApaⅠ位点是影响人群对骨关节结核易感性的位点之一；（2）人种以及地域差异；（3）本研究由于条件有限，选取样本不足，可能对结果造成一定程度的偏倚。

本课题首次就VDR基因ApaⅠ位点多态性与中国广东地区汉族人群骨关节结核病关系展开研究，VDR基因ApaⅠ位点多态性可出现两种等位基因（A和a）。这两种等位基因可组成三种基因型：AA、Aa、aa。基因型频率在病例组与对照组存在统计学差异，提示VDR基因ApaⅠ位点多态性在是骨关节结核发病的易感因素。其次，ApaⅠ-AA基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组，这与Selvaraj等^[18]在印度进行的病例对照研究结果不一致，说明了骨关节结核易感因素的复杂性。从遗传学的角度来看，人体对于骨关节结核的易感性是由多个基因共同影响的结果^[20]，并且对于受多基因影响的疾病而言，携带易感基因型的个体是否发病还受个体所处环境的影响。广东地区地理位置独特，携带易感基因的人群可能受此特殊环境的影响，导致发病率和发病人群异于别处。目前国内关于VDR基因ApaⅠ位点多态性与骨关节结核易感性的相关报道较少，本实验补充了我国广东地区骨关节结核患者与维生素D受体基因多态性的相关研究。在今后工作中我们将进一步采取尽可能严密、大样本、多中心临床实验，以进一步证实本研究的结论，为骨关节结核的早预防、早发现、早诊断提供理论依据。