环二鸟苷酸（c-di-GMP）是一种由两分子GTP缩合形成的环二核苷酸，为细菌中广泛存在的第二信使，参与调控多项细菌生理功能，并在人体固有的免疫应答中起免疫调节剂的作用^[1-2]。c-di-GMP信号通路的研究早期主要集中在革兰氏阴性菌中^[3]，近年来，在许多革兰氏阳性菌中也证明了其信号通路的存在，这些革兰氏阳性菌主要包括耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）^[4]、艰难梭菌（Clostridium difficile）^[5]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）^[6]和单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）^[7]等，而在乳杆菌属中尚未见报道。嗜酸乳杆菌是革兰氏阳性菌，能发酵多种糖，产酸能力强，可使菌斑pH下降，同时具有很强的耐酸能力，是公认的龋病相关主要细菌之一，与变异链球菌等一起被列为“龋标志菌”[8-9]。

前期通过生物信息学分析发现：在嗜酸乳杆菌的基因组中存在一个c-di-GMP合成酶（GGDEF）的编码基因（NH13_07045）和其两个分解酶（EAL）的编码基因（NH13_07050和NH13_07055）。

为验证嗜酸乳杆菌是否存在c-di-GMP的体内代谢途径，并为后续进一步探究c-di-GMP在嗜酸乳杆菌中的调控机制，基于上述分析及前期预试验的结果，本研究拟对NH13_07045-GGDEF结构域编码基因，及全长的NH13_07050和NH13_07055基因进行克隆、表达及纯化。以获得高纯度的目的蛋白并进行体外酶活性实验。

pMAL-c2-His表达质粒^[10]由本研究组提供。细菌基因组DNA抽提试剂盒，高保真DNA聚合酶及T₄ DNA连接酶（TaKaRa，日本）；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量抽提试剂盒（天根生物，北京）；BCA蛋白定量试剂盒，引物合成，三磷酸鸟苷（GTP），二磷酸鸟苷（GDP）及DNA测序（生工生物，上海）；限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ和PstⅠ（Promega，美国）；直链淀粉树脂（NEB公司，美国）；抗His标签小鼠多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（博士徳公司，武汉）；ECL化学发光底物（PerkinElmer，美国）；c-di-GMP，线性二鸟苷酸（pGpG）（Biolog，德国）。

嗜酸乳杆菌ATCC4356（广东省微生物菌种保藏中心），MRS培养基，LB培养基（青岛海博），大肠杆菌TOP10感受态细胞，BL21感受态细胞（本实验室提供），C43（DE3）感受态细胞（武汉淼灵生物）。

根据GenBank中嗜酸乳杆菌ATCC4356的NH13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13_07055片段序列设计合成特异性引物（表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 基因片段特异性引物 Table 1 Gene specific primers Genes of interest Sequence of primers Length of products NH13_07045-GGDEF F: 5'-GTCTGGATCCATGTATTATGAACAAAAGCAA-3' R: 5'-GTCTGTCGACTTAACCAATTAGGATTTTTGC-3' 546 bp NH13_07050 F: 5'-GTCTGTCGACATGTATAAGTGGCATAATGTG-3' R: 5'-GTCTCTGCAGTTAATAAATGTCTTCTAATTTGAGTG-3' 696 bp NH13_07055 F: 5'-GTCTGGATCCATGGTTAAATTAATATCTATTTTAACG-3' R: 5'-GTCTGTCGACTTATTTAATTTGTTGTGGCTTTTG-3' 804 bp

表 1 基因片段特异性引物 Table 1 Gene specific primers

对3个目的基因进行计算机分析。将它们相应目的蛋白的氨基酸序列输入NCBI网页的CDD^[11]数据库中进行序列同源性分析，寻找保守结构域。再使用TMHMM 2.0^[12]软件预测蛋白疏水跨膜区（图 1）。将冻干的嗜酸乳杆菌用MRS液体培养基37 ℃厌氧培养24 h，涂布于MRS固体培养基平板中，37 ℃厌氧培养48 h后常规接种，传代，涂片。取3 mL菌液离心获得菌沉淀后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜酸乳杆菌基因组DNA，并以其作为模板进行PCR扩增，分别获得3个目的基因片段。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物并从胶中分别回收，再用微量分光光度计NanoDrop2000定量浓度。

图 1(Figure 1)

图 1 嗜酸乳杆菌中c-di-GMP信号通路相关基因及蛋白的生物信息学分析 Figure 1 In silico analysis of the genes and proteins involved in c-di-GMP signaling in Lactobacillus acidophilus.

将pMAL-c2-His质粒及PCR产物分别进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分别回收酶切产物。微量分光光度计定量后，按照插入片段与线性化载体的摩尔比为5-10:1，用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜。次日转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含氨苄（100 μg/mL）的LB培养基琼脂平板，37 ℃培养过夜。然后挑选阳性克隆进行增菌培养，并提取质粒进行双酶切和PCR鉴定。将重组正确的质粒送至生工生物公司（广州）进行测序。测序正确的上述重组质粒分别命名为pMAL-7045-GGDEF、pMAL-7050和pMAL-7055。

将鉴定正确的重组质粒pMAL-7045-GGDEF，pMAL-7050转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，pMAL-7055转化到大肠杆菌C43（DE3）感受态细胞中，涂布于含有氨苄（100 μg/mL）的LB琼脂平板上，37 ℃孵育过夜。挑选阳性克隆分别接种至3 mL含氨苄（100 μg/mL）的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min震荡培养过夜。次日以1:100比例加入5 mL含氨苄（100 μg/mL）和0.2%葡萄糖的LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min震荡3 h至A_{600 nm}为0.6。此时，在pMAL-7045-GGDEF和pMAL-7050的转化菌培养基中加入终浓度为0.5 mmol的IPTG，在同样条件下诱导4 h；而在pMAL-7055的转化菌培养基中加入终浓度为0.25 mmol的IPTG，于25 ℃，120 r/min条件下诱导10 h。各诱导菌样品的制备和鉴定步骤为：取适量菌液在4 ℃、6000 r/min离心5 min，弃上清。沉淀菌以250 μL TBS重悬，吸取32 μL混悬液并加入8 μL 5×SDS上样缓冲液，混匀后沸水煮10 min，于12 000 g离心1 min，取20 μL上清进行上样，进行SDS-PAGE，一块胶用考马斯亮蓝（R-250）染色做蛋白条带分析，另一块胶用于表达蛋白的免疫印迹鉴定（详见1.2.4）。

上述蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，将胶中蛋白电转移至PVDF膜上并在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，TBST（20 mmol Tris-HCl、150 mmol NaCl、0.1% Tween-20、pH=7.4）洗涤2次，然后加入小鼠抗His-tag（一抗，1:300）于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中4 ℃孵育过夜。接着用TBST洗涤3次，然后用羊抗鼠IgG-HRP（二抗，1:5000）于室温中再孵育1 h，TBST洗涤3次。最后将吸干水分的PVDF膜置于BioRad荧光成像仪的托板上，在膜上均匀加上ECL化学发光液并进行自动曝光拍照，选取曝光适当的照片进行分析。

按上述表达菌的制备方法（1.2.3）制备200 mL的表达菌，离心后向沉淀菌中加入15 mL裂解液（10 mmol Tris-HCl、150 mmol NaCl、1 mmol EDTA、PMSF 17 ng/mL、0.2% Triton-X 100、Cocktail蛋白酶抑制剂、pH=7.4）重悬，于冰浴上进行超声裂解。而后16 000 g离心20 min取上清，缓缓加入并流经直链淀粉树脂柱（2 mL/min），再用Column buffer（10 mmol Tris-HCl、150 mmnol NaCl、1 mmol EDTA、pH=7.4）洗柱4次后，改用洗脱液（20 mmol Tris-HCl、150 mmol NaCl、1 mmol EDTA、0.2% Triton-X 100、10 mmol麦芽糖、pH=7.4）洗脱，收集洗脱液。取20 μL洗脱液行SDS-PAGE分析，剩余洗脱液加入甘油至终浓度为10%，储藏于-20 ℃备用。

将纯化的蛋白加入离心浓缩管（10000 cut-off），分别加入DGC酶活性缓冲液（50 mmol Tris-HCl、50 mmol NaCl、10 mmol MgCl₂、0.5 mmol EDTA、pH=7.4）或PDE酶活性缓冲液（50 mmol Tris-HCl、50 mmol NaCl、5 mmol MgCl₂、0.5 mmol EDTA、pH=9.35），进行蛋白浓缩及缓冲液置换，调整蛋白浓度至5 μmol。分别加入GTP和c-diGMP作为反应底物至终浓度为100 μmol，在100 μL体积中37 ℃反应2 h。随后，将样品加热至100 ℃，3 min灭活，16 000 g离心后取上清，使用0.22 μm滤器过滤，用作高效液相色谱分析。

高效液相色谱条件：安捷伦C18色谱柱（15×4.6 mm）；检测波长254 nm；流速0.7mL/min；进样量15 μL；柱温25 ℃；流动相A：100 mmol磷酸二氢钾，4 mmol四丁基硫酸氢铵，pH=5.9，流动相B：75%流动相A+25%甲醇；梯度条件（前者为时间（min），后者为流动相B的百分率）：0.0，0；2.5，0；5.0，30；10.0，60；14.0，100；21.0，100；22.0，50；23.0，0。通过将c-di-GMP、pGpG、GDP和GTP标准品的保留时间（RT）与样品进行比较后进行酶活性判定。

对嗜酸乳杆菌ATCC4356的基因组分析表明，3个目的基因分别是：一个含GGDEF结构的蛋白（NH13_07045）和两个含EAL结构的蛋白（NH13_07050和NH13_07055，图 1）。在此基础上，以ATCC4356基因组为模板，PCR扩增NH13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13_07055片段，1%琼脂糖凝胶电泳显示：特异性扩增产物与目的片段预期大小相符，分别为546、696和804 bp（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 目的基因扩增片段的1%琼脂糖电泳鉴定 Figure 2 Identification of 3 amplified target gene fragments in 1% agarose gel. M: DL2000 DNA marker; 1: amplified fragment of NH13_07045-GGDEF; 2: amplified fragment of NH13_07050; 3: amplified fragment of NH13_07055.

对3种重组质粒分别进行双酶切，酶切产物与自身未切割质粒进行1%琼脂糖凝胶电泳。结果表明，它们的酶切片段大小与预期相符。pMAL-7045-GGDEF为546 bp（图 3A）；pMAL-7050为696 bp（图 3B）及pMAL-7055为804 bp（图 3C）。此后对重组片段的测序结果也与GenBank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致。表明重组表达质粒构建成功。

图 3(Figure 3)

图 3 重组质粒双酶切产物的1%琼脂糖凝胶电泳 Figure 3 Identification of double enzymes digestion of the recombinant plasmids in 1% agarose electrophoresis. M1: DL2000DNA marker; M2: DL15000 DNA marker; 1: Double digested recombinant plasmid; 2: Undigested recombinant plasmid.

重组表达质粒pMAL-7045-GGDEF，pMAL-7050转化至大肠杆菌BL21中，pMAL-7055转化至大肠杆菌C43（DE3）中，经IPTG诱导表达后，产物经SDS-PAGE和Western blot分析（图 4），相对分子质量分别约为59 000、67 000和72 000，与预期的3个目的蛋白大小一致。用抗His-tag抗体的WB鉴定结果显示，3个特异性条带为含His标签的目的蛋白。

图 4(Figure 4)

图 4 3种目的蛋白表达产物的SDS-PAGE和Western Blot分析 Figure 4 SDS-PAGE and Western blot analysis for the expression of the 3 target proteins. M: Protein ladder; 1: Lysate from pMAL-7045-GGDEF/BL21; 2: Lysate from pMAL-7050/BL21; 3:Lysate from pMAL-7055/C43(DE3); 4, 5 and 6: Western blotting results corresponding to 1, 2 and 3 with anti-His tag Ab, respectively

分别将上述2.3中正确表达的菌体沉淀用超声裂解，其上清液经直链淀粉树脂亲和纯化后，用SDS-PAGE分析纯化前后样品的纯度及其相对分子质量。结果显示除pMAL-7055的纯化蛋白（72 000）中含少量降解蛋白外（图 5C），pMAL-7045-GGDEF（59 000，图 5A）和pMAL-7050（67 000，图 5B）均为较高纯度的目的蛋白。且3种纯化蛋白的相对分子质量与纯化前一致。

图 5(Figure 5)

图 5 目的蛋白纯化的SDS-PAGE分析 Figure 5 Analysis of purified proteins in SDS-PAGE. M: Protein ladder; 1: Lysate from induced bacterial; 2: Lysate from non-induced bacterial; 3: Purified target protein. A: pMAL-7045-GGDEF/BL21; B: pMAL-7050/BL21; C: pMAL-7055/C43(DE3)

高效液相色谱检测结果显示：以标准品的保留时间为参照（图 6A），NH13_07045的GGDEF结构域蛋白酶促反应产物与GDP和GTP标准品的出峰时间一致（图 6B）；NH13_07050酶促反应产物与pGpG标准品的出峰时间一致（图 6C）；NH13_07055酶促反应产物与c-di-GMP标准品的出峰时间一致（图 6D）。结果表明，NH13_07045-GGDEF结构域蛋白体外无DGC活性，仅表现出鸟苷三磷酸酶（GTPse）活性，把GTP转化成GDP；NH13_07050蛋白体外具有PDE活性，把c-di-GMP转化为链状二鸟苷酸（pGpG），而NH13_07055体外并无PDE活性。

图 6(Figure 6)

图 6 体外酶促反应产物的高效液相色谱分析 Figure 6 HPLC detection of in vitro enzymatic activity of the obtained proteins. A: Retention time of the peaks from standard samples; B: NH13_07045-GGDEF-encoded protein can hydrolyze GTP to GDP; C: NH13_07050-encoded protein hydrolyzes c-di-GMP to pGpG as PDE; D: NH13_07055-encoded protein has no PDE activity and can't hydrolyze c-di-GMP to pGpG.

c-di-GMP作为一种细菌纤维素合成酶的别构激活剂于1987年被首次发现^[13]。研究表明，c-di-GMP参与调节细菌的多项生理功能，包括细胞周期及分化、生物膜形成及分布、形态变化、致病因子和群感效应等^[14]。参与调节c-di-GMP合成和降解的蛋白酶广泛存在于各种细菌中，因此c-di-GMP被认为是一种细菌内普遍存在的第二信使分子^[3]。c-di-GMP的合成酶是含保守的GGDEF（Gly-Gly-Asp-Glu-Phe）氨基酸基序的二鸟苷酸环化酶（DGC），它可将GTP转化为c-di-GMP。而含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）为c-di-GMP的降解酶^[15]。这两种酶以底物循环方式维持菌体内c-di-GMP的平衡。

龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一，发病率高，发病涉及范围广。目前认为与龋病发生发展密切相关的菌种主要有变异链球菌、乳杆菌和放线菌等^[9]。其中乳杆菌在牙本质龋中具有明显的促进作用^[8]。对嗜酸乳杆菌ATCC4356的基因组分析表明，该菌株中含有一个编码具有GGDEF结构域的c-di-GMP合成酶基因及两个编码含EAL结构域的c-di-GMP水解酶基因。因此，嗜酸乳杆菌在引起龋病的进程中是否与c-di-GMP信号通路的调控相关，值得进一步探讨。

在预试验中我们发现，由于NH13_07045 N端含疏水性强的跨膜结构域，插入了NH13_07045全长基因的pMAL-c2-His质粒在IPTG诱导条件下，对大肠杆菌表达宿主BL21、TB1、ER2655和C43（DE3）均产生明显致死毒性，可能与其N端疏水的跨膜结构域有关。因而无法获得纯化蛋白用于后续实验。因此本课题组对NH13_07045的GGDEF结构域进行了单独表达纯化，用于酶活性实验。

ProOpBD^[16]数据库中检索结果提示，NH13_07045与NH13_07050存在于同一操纵子。用NH13_07045的氨基酸序列在NCBI CDD^[11]和TMHMM 2.0^[12]数据库检索，结果显示N端序列未发现已知的保守结构域，C端结构域含有保守的GGDEF结构。对跨膜区的预测显示，NH13_07045蛋白的N端结构域包含多次的跨膜结构，而其C端结构域则位于胞质。这种结构提示，c-di-GMP的合成有可能受到细菌外部或细菌细胞璧上的信号调控。研究显示，单独GGDEF结构域蛋白往往表现出较低甚至无DGC活性，仅表现出GTPse活性，原因可能是缺少了信号感受域，无法形成具有酶活性的同源二聚体构象^{[3, 17]}。据此，本课题组推测，NH13_07045-GGDEF结构域蛋白DGC活性的缺失，可能与缺少N端跨膜结构有关，相关内容将于下一步研究。

NH13_07050只含一个EAL结构域，其基因的5'端为一段121bp的非编码区，我们推测NH13_07050基因的表达调控与其密切相关。体外酶活性实验显示，NH13_07050具有高效的PDE活性，能使c-di-GMP水解成pGpG。

NH13_07055与NH13_07060存在于同一操纵子，NH13_07055的N端为单次跨膜结构域，C端为EAL结构域。NH13_07060为细菌表多糖聚-β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺（PNAG）的合成酶，与大肠杆菌的PgaC，单核李斯特菌的PssE蛋白序列比较，一致性为30%，且这两种蛋白合成表多糖的过程均受c-di-GMP的调控^{[7, 18]}。结合实验结果，我们认为，不具有PDE活性的NH13_07055可作为c-di-GMP的受体（本课题组实验结果表明其可与c-di-GMP特异性结合，数据另文发表），激活或者抑制嗜酸乳杆菌表多糖的合成通路。

含GGDEF结构域的膜蛋白功能分析^[19-20]以及c-di-GMP调控细菌表多糖合成^[21-22]的研究是近年来c-di-GMP信号通路的研究热点。因此本课题组在后续实验中将进行NH13_07045的体内酶活性实验，并对其跨膜结构进行功能分析。并且，对NH13_07055在c-di-GMP调控嗜酸乳杆菌表多糖合成中的作用也作进一步研究。

综上所述，本研究通过体外酶活性实验，检测到NH13_07050具有PDE活性，为后续阐明c-di-GMP在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据，从而为龋病的防治提供了新视野。