热疗是一种将肿瘤组织温度加热至40~43 ℃的治疗方法，因其对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用，通常作为肿瘤治疗的辅助手段^[1-3]。热疗诱导细胞死亡的分子生物学机制仍然不清楚，可能与蛋白折叠错误、聚集有关^[4]。然而，细胞在热应激的时候会产生一系列保护性反应，如如引起Hsp27、Hsp70和Hsp90等表达上升^[5]，其中Hsp90对折叠错误蛋白的命运起关键作用。Hsp90主要包括两种亚型，分别为应激诱导表达升高Hsp90α和结构性表达的Hsp90β ^[6]。Hsp90在细胞内主要是发挥分子伴侣功能，促进蛋白的折叠、稳定和介导蛋白降解^[6]，其底物蛋白超过200种，其中包括转录因子、激酶、类固醇激素受体等^[7]。在热疗中发生变性的蛋白大部分被Hsp90重新折叠或者介导降解^[8]，而主要负责细胞内蛋白降解的是26S蛋白酶体^[9-10]。26S蛋白酶体由核心复合物20S催化颗粒19S调节颗粒组成^{[9, 11]}。近期发现，26S蛋白酶体的表达与Hsp90的功能相关^[9]，但是在热疗过程中26S蛋白酶体的变化以及是否同样受Hsp90调控尚未明。本研究以26S蛋白酶体的量及活性为标志，探索在热疗时Hsp90对26S蛋白酶体的影响。

HepG2细胞株为本实验室冻存保种；DMEM基础培养液、胎牛血清购自于Life technologies公司；Hsp90大鼠单抗、26S蛋白酶体小鼠多抗购于Santa Cruz公司；Brad-ford DC蛋白质定量试剂盒购自BIO-RAD公司；ROS探针DCFH-DA、MTT、蛋白酶体活性测定试剂盒均购于Sigma公司。

对照组细胞培养于37 ℃，热疗组细胞贴壁24 h后于42 ℃二氧化碳培养箱（Thermo 3111）培养不同时间（2、4、6、8、12和24 h）。

热疗不同时间后，使用DCFH-DA 37 ℃染色15 min。PBS洗去多余的染料，然后消化细胞，PBS洗涤，流式细胞仪（Guava，Millipore）488 nm激发，535 nm检测荧光强度。

在96孔板中每孔加入1×10⁴细胞，贴壁24 h后，热疗不同时间。加20 μL MTT培养4 h，吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使用酶标仪（Thermo MK3）在波长490 nm处检测各孔的吸光度（A）值。

细胞贴壁24 h后（融合率约50%），使用Lipofectamine 2000将针对HSP90α的siRNA序列（5'-AAUCCGGUAUGAAAGCUUGAC-3）'或空白对照（NC）序列转染至细胞，24 h后换液并用于下游实验。

在96孔黑板中每孔加入1× 10⁴细胞，贴壁24 h后，热疗不同时间。热疗后立即使用蛋白酶体20 S活性检测试剂盒检测每孔的荧光值，每孔荧光值与对应热疗时间后的MTT值之比即为每个细胞的发光度。

实验结果使用IBM SPSS 24作统计分析，数据使用重复测量的方差分析或析因设计的方差分析，两两比较使用LSD法，对于所有检验α=0.05。

热疗能使蛋白变性^[12]，然而热疗过程中，是否还有其他因素协同作用使蛋白变性仍不清楚。因此，我们首先检测引起蛋白变性的常见物质—ROS ^[13]。HepG2细胞经过0~24 h热疗后，使用流式细胞仪测量每个细胞的ROS水平，结果如图 1所示。热疗后，细胞内ROS升高（重复测量的方差分析，F=28.958，P < 0.001），且随着热疗时间越长，ROS水平越高。热疗6 h后，细胞内ROS水平已较对照组多51%。此结果表明，热疗过程中，细胞内ROS会不断累积。

图 1(Figure 1)

图 1 不同热疗时间对HepG2细胞内ROS的影响 Figure 1 Effect of heat shock to ROS production in HepG2 cells (Mean ± SD, n=3). a: Compared with 0 h, P < 0.05; b: Compared with 3 h, P < 0.05; c: Compared with 6 h, P < 0.05).

为检测热疗是否会影响细胞的增殖，下一步我们检测HepG2细胞在热疗时的增殖情况。细胞经过0~24 h热疗后，使用MTT检测细胞数，结果如图 2所示。HepG2细胞经不同时间热疗后，细胞数逐渐下降（重复测量的方差分析，F=621.704，P < 0.001），经过24 h热疗后细胞数量减少至原来的51%。从结果可知，热疗能抑制细胞增殖，并使细胞数量减少。

图 2(Figure 2)

图 2 HepG2细胞经过不同时间后热疗后，细胞数的变化情况 Figure 2 Changes of HepG2 cell numbers after hyperthermia (Mean±SD, n=3). a: Compared with 0 h, P < 0.05; b: Compared with 3 h, P < 0.05; c: Compared with 6 h, P < 0.05; d: Compared with 12 h, P < 0.05.

热应激以及大量ROS产生的过程中，细胞内蛋白会变性，变性后的蛋白如果不能及时复性或被降解，细胞则会发生非折叠蛋白反应而凋亡，而HSP90和蛋白酶体则对蛋白复性和降解起到关键作用^[14]。下一步检测热疗过程中，HSP90α的变化情况，热疗后，细胞内Hsp90a表达量增加（重复测量的方差分析，F=27.403，P=0.035），12 h后增多最为明显，到24 h时稍有下降。26 S蛋白酶体是真核细胞内负责蛋白质降解的主要分子机器，因此通过检测26 S蛋白酶体的量可反映蛋白酶体的量。热疗过程中，26 S蛋白酶体（26 S proteasome）表达量随着热疗时间的延长而减少（重复测量的方差分析，F=164.174，P < 0.001）。结果提示，热疗过程中，26 S蛋白酶体的表达趋势与HSP90α相反，提示26 S蛋白酶体的表达可能与HSP90α功能相关。

为进一步探索26 S蛋白酶体的量是否与HSP90功能相关，下一步使用HSP90α干扰序列干扰HSP90后，观察热疗24 h后的26 S蛋白酶体的变化，结果如图 4所示，数据使用释因设计的方差分析进行统计分析。热疗24 h后，HSP90α增多而26 S蛋白酶体减少，变化趋势跟上述一致；当干扰HSP90α后，HSP90α显著减少（F= 68.255，P < 0.001）；但干扰HSP90α后，24 h热疗使HSP90α和26 S蛋白酶体进一步减少（F=180.231，P < 0.001）。以上结果表明，26 S蛋白酶体的量受HSP90α的量和功能密影响，HSP90α减少或者功能收限时，26 S蛋白酶体的量也随之而减少。

图 3(Figure 3)

图 3 热疗对Hsp90α和26 S蛋白酶体的表达的影响 Figure 3 Effect of heat stress on expression of Hsp90α and 26 S proteasome. A: HSP90α and 26 S proteasome detected by Western blotting; B: Gray value analysis (Mean±SD, n=3). (a: Compared with 0 h, P < 0.05; b: Compared with 3 h, P < 0.05; c: Compared with 6 h, P < 0.05; d: compared with 12 h, P < 0.05).

图 4(Figure 4)

图 4 Hsp90α对26 S蛋白酶体的表达的影响 Figure 4 Effect of Hsp90α on the expression of 26 S proteasome. A: HSP90α and 26 S proteasome detected by Western blotting; B: Gray value analysis (Mean±SD, n=3). (a: Compared with 0 h, P < 0.05; b: Compared with 3 h, P < 0.05; c: Compared with 6 h, P < 0.05).

26 S蛋白酶体的量在热疗过程中先升高而后下降，然而蛋白酶活性是否改变仍不清楚。下一步将检测热疗过程中26 S蛋白酶体活性的变化。热疗过程中，26S蛋白酶体活性变化如图 5所示。在热疗的过程中，26S蛋白酶体活性呈先升高后下降的趋势（重复测量的方差分析，F=133.043，P < 0.001）。在前6 h，26 S蛋白酶体活性较对照组稍有上升，而在6 h以后，蛋白酶体活性逐渐降低，热疗24 h时，蛋白酶体活性下降至对照组的49.98%。以上结果表明，长时程热疗除使蛋白酶体的量下降，也会抑制蛋白酶体活性。

图 5(Figure 5)

图 5 热疗不同时间后，26 S蛋白酶体活性的变化 Figure 5 Changes of 26 S proteasome activity at different time points of heat shock (Mean±SD, n=3). (a: Compared with 0 h, P < 0.05; b: Compared with 3 h, P < 0.05; c: Compared with 6 h, P < 0.05; d: Compared with 12 h, P < 0.05).

热疗能使蛋白错误折叠和聚集，数分钟内的热疗能使大部分蛋白和RNA聚合在一起形成应激颗粒^[4]。应激颗粒的形成可能是细胞对热疗的保护性反应之一，因为在热疗后的恢复期，这些应激颗粒会逐渐被打开，蛋白复性而且不会被降解，在蛋白复性过程中，需要众多热休克蛋白的参与^[4]。大部分变性蛋白最终需要经过Hsp90的最后折叠才能恢复成正确的构象^[15]。当热疗时间变长时，细胞内产生越来越多ROS。在ROS还原过程中可导致众多蛋白和脂质被氧化，使细胞发生氧化应激^[16]，导致蛋白进一步变性^[17]。

细胞受应激后，Hsp90α会诱导性表达增多，使细胞适应应激，起到自我保护的作用。在应激过程中，变性的蛋白需要被重新折叠，Hsp70和Hsp40能联合识别变性蛋白，然后传递至Hsp90，由Hsp90完成最后的折叠过程^[6]。若变性的蛋白不能重新折叠且蓄积过多，细胞就会发生未折叠蛋白反应^[18]。UPR涉及3个方面：开始时中止蛋白翻译以恢复细胞功能；降解折叠错误的蛋白；上调涉及蛋白折叠的分子伴侣^[19]。热疗使细胞产生大量变性的蛋白，这些蛋白若不能及时被修复或者降解，细胞就会因蛋白平衡紊乱然后凋亡。本研究发现，在热疗时，随着热和越来越多的ROS作用于细胞，虽然Hsp90α也有所升高，但是轻微升高的Hsp90α不能完全保护细胞对抗热环境，热疗24 h时，细胞数已显著下降。

热休克蛋白和泛素-蛋白酶系统紧密合作以维持细胞内的蛋白稳态。大部分细胞内的蛋白经泛素化后，由26 S蛋白酶体降解^[20]。而变性蛋白可通过与HSP90结合而泛素化^[21]。HSP90对底物蛋白的调节需要多种共伴侣分子的参与，其中共伴侣分子CHIP是一种泛素连接酶^[22]，当HSP90和底物蛋白结合后，CHIP与HSP90结合就会使底物蛋白泛素化^[23-24]，促进底物蛋白的降解。但是26 S蛋白酶体的组装也受HSP90调节，19 S调节颗粒与20 S核心颗粒的结合成26S蛋白酶体需要HSP90组装和维持，当缺乏HSP90的协助时，26 S蛋白酶体将变得不稳定^[25]。热疗过程中，由于蛋白持续变性，大量HSP90被分配于稳定变性蛋白，导致26 S蛋白酶体缺乏HSP90协助组装，使26 S蛋白酶体随着热疗时间的延长而逐渐减少。虽然热疗12 h后，细胞内HSP90α表达大幅增多，但由于变性蛋白继续消耗新增加的HSP90α，导致26 S蛋白酶体同样不能得到HSP90的稳定，最终26 S蛋白酶体在热疗过程中逐渐减少。同样地，由于缺乏HSP90协助26 S蛋白酶体组装，使得26 S蛋白酶体活性在热疗中逐渐下降。最后导致变性蛋白不能被降解而堆积在细胞中。

综上所述，随着热疗时间延长，细胞内ROS含量越来越高，热和ROS共同使蛋白变性，是细胞发生未折叠蛋白反应；虽然热应激使细胞内Hsp90α上调有助于重新折叠变性了的蛋白，但是由于持续的热疗和越来越多的ROS，使细胞内变性蛋白越来越多，增多了的HSP90α不足以维持所有蛋白的稳定，因此，不能被重新折叠的蛋白只能通过蛋白酶体途径降解。然而热疗过程中由于Hsp90α主要被用于维持变性蛋白的稳定，致使26 S蛋白酶体缺乏Hsp90α的分子伴侣作用，26 S蛋白酶体最终数量减少，通过干扰Hsp90α进一步确证26 S蛋白酶体的组装依赖于Hsp90α；同时，20 S蛋白酶体活性也随着热疗时间的延长而降低，最终使得变性蛋白不能被有效降解，使细胞发生死亡。通过本研究，明确了在热疗过程中，依赖于Hsp90功能进行组装的20 S蛋白酶体数量和活性均下降，减少变性蛋白的降解，进一步加剧未折叠蛋白反应而使细胞死亡，为热疗杀灭肿瘤细胞的机理提供理论依据、为治疗肿瘤提供新的治疗策略。