在临床工作中，立体定向技术在功能神经外科发展迅速，应用广泛^[1-3]。在动物实验中，使用立体定向技术能为各种研究提供支持，包括靶点给药^[4]、损毁^[5]、颅内移植^[6-8]等。传统的立体定向穿刺方法大多通过垂直穿刺法，但是对于定位在中线者，实验动物容易在术中出现上矢状窦出血而死亡，死亡率较高。另外，一些实验的目标核团在深部，并且有避开某些核团的，或者进针路径沿着核团长轴的需要，因此国内外学者开始探索斜向入路穿刺的方法。陈起亮等^[9]通过与脑矢状面成8°穿刺大鼠垂体和弓状核；石林等^[10]学者对比了斜向立体定向穿刺法与垂直立体定向穿刺法的差别；Seidman等^[11]为避开横窦，选择由后往前与冠状面成20°穿刺。但是以往文献多无给出具体的计算方式，石林等^[10]斜向定位方法计算及操作步骤均复杂。因此，建立一种简单易行且稳定性、重复性好的立体定向穿刺方法至关重要。由于过去有学者^[12]穿刺邻近上矢状窦的核团，发现动物容易死亡，而且已经有文献表明大鼠上矢状窦受刺激后会出现抑郁^[13]、偏头痛^[14]等不良现象。因此，本研究以斜向定位穿刺至视上核（垂直穿刺容易损毁上矢状窦）为例，介绍一种操作简便，计算过程简单，术中安全性高的斜向穿刺方法。

SD大鼠18只[由南方医科大学动物实验中心提供，SPF级，许可证号：SCXK（粤）2011-0015]，体质量220~260 g，小动物麻醉系统，吸入性麻醉剂异氟烷，牙科钻（瑞沃德），电损毁仪（UGO），Hamilton微量注射器，立体定向仪（Stoelting，51603）。

取18只SD大鼠随机分为斜向穿刺组（实验组，9只）和垂直穿刺组（对照组，9只），禁食、禁水12 h，两组均以异氟烷诱导（浓度4%）、维持（浓度2.5%）进行气体吸入性麻醉。

按照国内外文献[15-16]垂直状态下立体定向垂步骤，参考Paxinos & Watson^[17]大鼠鼠脑图谱，找到视上核的相对坐标为（1.0，1.5，9.3），[即以前囟为零点（0, 0, 0），向后移动1.0 mm，旁开1.5 mm，深度为9.3 mm]之后，用牙科钻钻孔开颅，压迫止血，垂直穿刺至视上核，电极电流1 mA，损毁15 s后拔针，再次压迫止血，缝皮，置笼观察。

斜向穿刺具体步骤（以经左侧偏转20°穿刺视上核为例）：（1）SD大鼠固定于立体定向仪头架上，备皮消毒并沿着大鼠顶骨正中切开头皮暴露颅骨，而微量注射器固定于垂直位置（图 1A）；（2）通过移动立体定向X轴，Y轴以及Z轴方向，使得微量注射器针尖恰好接触大鼠前囟点，并记录下当前的坐标位置为（31.2，48.7，72.2）；（3）参考Paxinos & Watson^[17]大鼠鼠脑图谱，左侧视上核位置与前囟的坐标差为（1.0，-1.5，-9.3），经过计算，坐标（32.2，47.2，62.9）应为左侧视上核于垂直方向的坐标；（4）在Z轴方向上移微量注射器（避免稍后X轴方向和Y轴方向上移动时针尖与大鼠顶骨摩擦而变弯），然后移动微量注射器使得针尖X轴与Y轴位于坐标（32.2，47.2）的位置，此时不必移动Z轴方向的坐标；（5）于Z轴方向缓慢下移微量注射器，使得针尖刚好接触大鼠颅骨后，双眼注视针尖与颅骨接触点，缓慢于Z轴方向上移微量注射器，同时用笔标记接触点Ⅰ位置（图 1B）；（6）通过调节角度，使得微量注射器向左侧偏转，与矢状面成20°，并且通过移动X轴和Z轴方向，使得微量注射器针尖与接触点Ⅰ重合，并记录当前坐标（59.0，47.2，38.4，图 1C）；（7）因于垂直位置下Z轴方向应向下移动9.3 mm，故转换为斜向后，应在X轴上向右移动9.3*sin20°=3.2 mm，Z轴上向下移动9.3*cos20°=8.7 mm，而Y轴方向不必移动，即目标核团与步骤6中的坐标（59.0，47.2，38.4）的相对坐标为（3.2，0，-8.7），故目标核团于斜向位置下坐标应为（62.2，47.2，29.7）；（8）于Z轴方向上移微量注射器一段距离后（避免稍后移动X轴针尖接触到大鼠颅骨），向X轴方向上向右移动使得X轴坐标到达62.2，在Z轴方向缓慢向下移动微量注射器，使得针尖与大鼠颅骨巧好接触时双眼注视接触点像步骤5所说方法标记接触点Ⅱ（图 1D）；（9）标记接触点Ⅱ后，通过X轴与Z轴向左和向上移动开微量注射器后，使用牙科钻于接触点Ⅱ钻孔；（10）钻孔后，压迫止血，然后使坐标移动至（62.2，47.2，29.7），进行斜向穿刺；（11）到达目标核团后，电极通电，电流1 mA，损毁15 s，拔针，然后压迫止血，缝皮，置笼观察。图 2为其几何学上的计算原理，x'=z*sinɑ，y'=0, z'=z*cos ɑ（其中x，z为垂直位置下目标核团与前囟的相对位置；x'，y'，z'为斜向位置下目标核团与1.2.1中接触点Ⅱ的相对位置）。

图 1(Figure 1)

图 1 大鼠立体定向斜向穿刺步骤 Figure 1 Procedures of oblique stereotactic puncture in rats. A: Targeting the bregma, marking it as the point O; B: Moving to the target coordinate, marking it as black point I; C: Placing the needle at the black point I at an oblique angle; D: Moving to the red point II.

图 2(Figure 2)

图 2 穿刺的冠状面 Figure 2 The coronal plane of the puncture. O: Bregma; A: Position of the puncture needle in Fig. 1A; B: Position of the puncture needle in Fig. 1B; C: Position of the puncture needle in Fig. 1C; D: Position of the puncture needle in Fig. 1D. I: The black point I. II: The red point II. Dark red area: The superior sagittal sinus.

简洁步骤：第1步：定前囟位置，记录立体定向仪3个轴（x, y, z）的坐标读数分别为a、b、c。第2步：查图谱，确定目标核团与前囟在3个坐标上的相差的具体读数分别为d、e、f。第3步：将立体定向仪X轴及Y轴移动至g、h显示的数据的位置, 标记接触点I，其中g=a-d，h=b-e。第4步：调节角度，倾斜状态与接触点I重合，记录当前坐标（i, j, k）以及倾斜角度ɑ。第5步：得出倾斜状态下目标核团坐标（l, m, n），其中l=i-f*sinɑ, m=j, n=k+f*sinɑ，并穿进刺针，达到该坐标位置。

所有手术均由同一个人进行，而术前、术中、术后数据统计均由统计教研室完成。术前所需统计的数据包括：两组大鼠术前体质量和性别；术中所需统计的数据包括：两种核团定位方法所需时间T₁（即从头皮切开后到用牙科钻开颅骨时间）、两组术中上矢状窦破裂率P₁、两组钻孔后止血时间T₂、拔针后止血时间T₃、手术完成所用时间T₄（从头皮切开到拔针后缝皮，由于两组留针时间相同）；两组术后24 h大鼠死亡率P₂。所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料采用均数±标准差表示，经检验数据均符合正态分布且方差齐。采用独立样本t检验以及χ²检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

实验组和对照组均顺利完成手术，术中均无出现死亡。虽然实验组中核团定位所用时间T₁大于对照组，但是，实验组术中上矢状窦破裂率P₁、钻孔后止血时间T₂、穿刺后止血时间T₃、以及手术完成所用时间T₄、大鼠术后24 h死亡率P₂均低于对照组，有统计学差异。两组大鼠一般资料、手术情况和术后死亡率具体数据见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 两组大鼠一般资料、手术情况和术后死亡率 Table 1 Surgical data and mortality of the rats in the 2 groups Item OSP group (n=9) VSP group (n=9) t/χ2 P Weight（g） 224.56±15.13 233.67±11.71 1.428 0.172 T1（s） 59.55±3.64 27.44±2.18 13.097 0.000 P1 11.1% 88.9% 10.889 0.003 T2 (s) 52.89±24.05 157.44±38.19 6.949 0.000 T3 (s) 24.33±10.60 133.89±28.81 10.705 0.000 T4（s） 178.89±35.22 362.44±66.52 7.316 0.000 P2 0 0.444 5.143 0.082 T1: Time for locating supraoptic nucleus; T2: Hemostatic time after craniotomy; T3: Hemostatic time after puncture; T4: Time for operation; P1: Rupture rate of the superior sagittal sinus; P2: The mortality during postoperative 24 hours.

表 1 两组大鼠一般资料、手术情况和术后死亡率 Table 1 Surgical data and mortality of the rats in the 2 groups

动物立体定向技术是神经生物研究的基础，配合不同的针尖和导管进行电生理^[18-19]、脑室给药^[20]、微透析^[21]和光遗传学^[22]等技术。但是常规的定位和穿刺方法是垂直路径进针，到达目标核团，但是实际研究工作中会有对颅脑中线及附近结构的研究，以常规路径的方法，必然会经过上矢状窦，穿刺时会出现大出血，严重者动物会当场死亡^[12]；另外，某些对深部核团的研究，为了避开某些浅部的功能核团，同样不能按垂直路径穿刺，例如切除垂体模型因为所处位置较深选择咽旁入路切除^[23-24]或者经耳抽除^[25]，但这些方法因没有使用立体定向定位而导致位置不准确；再有，损毁核团的坐标设计应依循图谱上最大面积的层次作为坐标，而一些核团或结构会有一定的长轴形态，如果根据长轴损毁可以达到全损效果，而且减少对其他无关组织的损伤^[10]。但是，使用本研究中的斜向定位穿刺技术便可满足以上需求。

目前国内外部分学者也对斜向定位穿刺技术也进行了探讨和实验。但是，以往文献较少涉及立体定向方案的具体的计算方式。其中，石林等^[10]定位方法从定前囟即调整角度，后需要通过复杂的计算得出：斜向穿刺的核团深度较垂直穿刺增加了[（1/^*cos α-1）^*z]mm，旁开距离较垂直亦增加了[（z^*tg α+x）^*cos α-x]mm，再进行穿刺，而且具体步骤同样不详。本研究中提出的方法操作简便，计算简单，其技术的精髓在于在垂直位置上先移水平和前后方向后，再调整偏转角度，重新调零，再通过移动斜向位置上的X轴和Z轴以达到垂直位置的深度。

图 3(Figure 3)

图 3 斜向穿刺损毁大鼠视上核 Figure 3 Electrical lesion of the supraoptic nucleus (sagittal plane, Original magnification: × 10). A: The supraoptic nucleus of a normal rat; B: The supraoptic nucleus with electrical lesion in oblique stereotactic puncture (OSP) group. Dashed area: Supraoptic nucleus. *: The electrical lesion point.

斜向穿刺法在核团定位时间比垂直穿刺稍长，但整个手术完成时间比垂直法短。由于对照组上矢状窦破裂率高，止血时间长，不仅影响手术完成时间，而且还造成术后大鼠预后不良甚至死亡。而在实验组中，由于选择了斜向穿刺的方法，就穿刺视上核而言，巧妙地避开了上矢状窦，即使是初学者操作，也能大大减少开颅时候动物出血量，提高实验的成功率。除此之外，鉴于多数核团的长轴方向并非成垂直方向，而是与正中矢状面成一定的角度，所以斜向穿刺法也能为术者提供更多更完美的穿刺路径^[10]。立体定向仪精确度为2°，最大偏差2°，在进针后与目标位置最大偏差距离为：深度^*（sin 20-sin18）=9.3 mm^*（sin 20-sin18）=9.3^*（0.34-0.31）=0.28 mm。该距离不会导致穿刺针偏离视上核。另外，使用本斜向穿刺还有一个不足之处是观测误差，在调整角度时，因仪器本身和使用者目测或环境因素的原因，客观上不能保证每次操作都精确调准角度，对此本研究并进行矫正和相关研究。在实际工作中，我们推荐定时养护仪器；倾斜角度时以刻度允许的范围调整，即最小角度间隔为2度；调整时使用者视线应与刻度同一水平；工作环境温度在22 ℃~25 ℃。

总而言之，本研究中提出的斜向穿刺方法步骤具体，方法简单。就穿刺视上核而言，选择斜向穿刺法因巧妙避开上矢状窦，大鼠术中止血时间短，术后死亡率低，穿刺安全性更高。本研究提出的斜向穿刺法能为不同实验提供更多的手术入路，值得推广。