类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎性病变为主要特征的慢性自身免疫性疾病，主要表现为滑膜炎症及增生、自身抗体的产生、软骨及骨的破坏，严重者关节功能丧失，甚至畸形、伤残^[1-2]。1977年，Trentham^[3]在50%的RA患者血清中发现了抗Ⅱ型胶原（CⅡ）的自身抗体，随后成功建立了Ⅱ型胶原诱导的类风湿关节炎模型（CIA），其临床症状和病理变化与人类RA相似。虽然RA的发病机制尚未明确，但有研究表明CD4+T细胞参与RA的发生及发展^[4]，主要表现为Th1/Th2 平衡向Th1 倾斜，Th17/Treg 平衡向Th17 倾斜^[5-6]。近年来，有学者报道视黄酸可以通过激活视黄酸受体和类视黄醇X受体，调节T细胞的分化，减少促炎因子的释放，发挥免疫调节的作用^[7-9]。本课题组前期研究结果也证实，全反式视黄酸（ATRA）对CIA大鼠的炎性症状具有一定的缓解作用^[10]。但是，预防性给药对RA的预防及缓解作用尚不清楚。对此，本实验于CIA诱导开始时预防性给予大鼠不同剂量的ATRA，探讨ATRA对RA的预防作用及其机制。

60只SPF级健康Wistar雌性大鼠，6~8周龄，体质量200±20 g，由成都达硕实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（川）2013-24 0017735。四川大学华西公共卫生学院实验动物中心SPF动物房饲养，5只/笼，饲料和饮水由实验动物中心供给，实验动物使用许可证号为SYXK（川）2011-011。

牛CⅡ和不完全弗氏佐剂（美国Chondrex）；ATRA（美国Sigma）；Aladdin玉米油（上海晶纯）；TNF-α、IL-10、IL-17A的ELISA试剂盒（均购于美国eBiosicence）；抗解整链蛋白金属蛋白酶（ADAMTS-4）抗体（武汉博士德）；抗基质金属蛋白酶（MMP-1）抗体（Abnova）；抗基质金属蛋白酶（MMP-3）抗体（Abcam）；抗金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）抗体（Biorbyt）；超敏二步法免疫组化检测试剂盒、生物素-链霉卵白素免疫组化试剂盒和浓缩型DAB试剂盒（均购于北京中杉金桥）；其它化学试剂均为国产分析纯。

高压蒸汽灭菌器（上海申安）；超净工作台（苏州安泰）；手持匀浆器（德国IKA）；低温冷冻离心机（美国ThermoFisher）；酶标仪（美国BIO-RAD）；电子天平（德国Sartorius）；显微镜（德国Leica）。

将Wistar大鼠随机分成空白对照组、溶剂对照组、ATRA低剂量组、ATRA中剂量组、ATRA高剂量组，每组12只。

溶剂对照组和ATRA各剂量组给予胶原诱导关节炎模型，方法同前期研究报道^[10]。空白对照组给予等量生理盐水，给药方式与诱导关节炎模型相同。

自初次免疫后第1天起，ATRA低、中、高剂量组大鼠腹腔注射给予0.05、0.5、5 mg/kg的ATRA玉米油溶液，空白对照组和溶剂对照组分别腹腔注射等体积的生理盐水和玉米油，每周3次，连续3周。

加强免疫后，采用AI评分标准进行评分，1次/3 d。实验员经统一培训后，采用双人同时独立评分，以二者均值进行统计分析。

初次免疫后第24天，以40 mg/kg的戊巴比妥钠对大鼠进行腹麻醉，取血后处死，分离出双侧膝踝关节，甲醛固定、脱钙后石蜡包埋、切片，HE染色显微镜下观察关节的组织形态学变化。

按照Masakazu分级法（5级）^[11]对关节病理损伤进行总体半定量评分，并单独对关节滑膜炎进行半定量评分^[12]。评分采用双人单独评分，取均值进行统计分析。

按ELISA试剂盒操作说明书，测定大鼠血清中相关炎性细胞因子IL-10、IL-17A、TNF-α的表达水平。

采用SP二步法测定ADAMTS-4，PV二步法测定MMP-1、MMP-3、TIMP-1，方法同前期研究^[10]。4 个指标一抗稀释倍数依次为：ADAMTS-4，1∶400；MMP-1，1∶100；MMP-3，1∶200；TIMP-1，1∶200。用Image-Pro Plus6.0图像处理软件进行染色区域光密度分析，测量平均光密度值（A）。

实验结果采用SPSS 17.0进行统计分析，统计结果均以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐时用Games-Howell校正，重复测量的数据采用重复测量资料的方差分析，当P＜0.05认为差异有统计学意义。

初次免疫后第13天，大鼠开始出现关节红肿，表皮温度升高。第15天开始进入出模高峰期。与空白对照组大鼠相比，CIA大鼠体质量增长缓慢，毛发无光泽且轻微脱毛，后足体积和形态上出现明显变化（图 1），可见暴躁、攻击等行为表现。实验后期，CIA大鼠出模率为67%。

图 1(Figure 1)

图 1 正常大鼠和CIA造模大鼠 Figure 1 Hindlimb joints of a normal rat (A) and a CIA rat (B).

重复测量资料的方差分析发现：ATRA各剂量组大鼠AI值差异有统计学意义（P＜0.05），且时间和剂量间存在交互作用（P＜0.05）。从第15天开始，溶剂对照组的AI评分趋于平稳，ATRA各剂量组的AI评分呈上升趋势，但ATRA各剂量组出模大鼠的AI评分显著低于溶剂对照组；ATRA低、高剂量组与溶剂对照组差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 不同时间点上大鼠的关节炎指数 Table 1 Changes of arthritis index over time in different groups(n=8) Group 15 days 18 days 21 days Normal control group 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 Solvent control group 7.30±1.13* 7.45±1.43* 7.7±1.89* ATRA low-dose group 3.89±3.89# 4.44±3.36#△ 4.78±3.07#▲ ATRA middle-dose group 5.75±2.92 6.38±2.77△ 6.75±2.55▲ ATRA high-dose group 4.45±4.37# 5.00±3.95#△ 5.64±4.34#▲ *P＜0.05 vs normal control group; #P＜0.05 vs solvent control group; △P＜0.05 vs 15 d; ▲P＜0.05 vs 18 d

表 1 不同时间点上大鼠的关节炎指数 Table 1 Changes of arthritis index over time in different groups(n=8)

HE染色结果示空白对照组膝、踝关节结构完整，关节软骨面及关节腔间隙正常；相较于空白对照组，溶剂对照组可见纤维组织增生，滑膜组织向软骨面爬行形成血管翳，踝关节结构可见明显改变，关节软骨面大量脱落，可见骨侵蚀，大量新生骨组织形成严重的软骨破坏，关节腔间隙明显缩小；ATRA各剂量组膝关节损伤较溶剂对照组轻，关节软骨面结构正常或可见脱落，有少量血管翳，少量滑膜组织爬行形成血管翳，踝关节较膝关节受累严重，关节软骨面脱落，新生骨组织形成软骨破坏，关节腔间隙相对缩小（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 大鼠膝关节和踝关节HE染色 Figure 2 HE staining of the knee joints (upper panel) and ankle joints (lower panel) of the rats (Original magnification: × 40). A, F: Normal control group; B, G: Solvent control group; C, H: ATRA low-dose group; D, I: ATRA middle-dose group; E, J: ATRA high-dose group.

与空白对照组相比，其余各组关节病理损伤评分差异有统计学意义（P＜0.05）；ATRA各剂量组评分低于溶剂对照组，但仅高剂量组的踝关节评分差异有统计学意义（P＜0.05）；其余各组评分两两比较无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组相比，其余各组滑膜炎评分均有差异（P＜0.05），但两两比较差异无统计学意义（P＞0.05，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 对关节病理损伤的影响 Table 2 Effect of ATRA on joint pathological damage scores (n=8) Group Masakazu score of keen Masakazu score of ankle Synovitis score of knee Synovitis score of ankle Normal control group 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 Solvent control group 2.08±2.28* 5.58±2.01* 1.25±1.60* 3.75±1.33* ATRA low-dose group 1.81±0.92* 4.31±1.79* 0.93±0.32* 2.81±1.46* ATRA middle-dose group 1.81±1.51* 4.87±2.24* 1.31±1.03* 3.68±1.81* ATRA high-dose group 1.61±1.83* 3.72±1.75*# 1.00±1.14* 2.56±1.21* *P＜0.05 vs normal control group; #P＜0.05 vs solvent control group.

表 2 对关节病理损伤的影响 Table 2 Effect of ATRA on joint pathological damage scores (n=8)

表 3(Table 3)

表 3 对细胞因子水平的影响 Table 3 Effect of ATRA on cytokine levels (n=8) Group L-10 IL-17A TNF-α Solvent control group 107.66±33.06 4.00±0.83 97.69±4.78 ATRA low-dose group 159.36±35.68# 3.31±0.90 85.93±4.61# ATRA middle-dose group 108.23±14.55 3.01±0.80# 95.07±17.18 ATRA high-dose group 153.90±39.46# 2.82±0.72# 84.25±7.31# #P＜0.05 vs solvent control group

表 3 对细胞因子水平的影响 Table 3 Effect of ATRA on cytokine levels (n=8)

ADAMT-4、MMP-1、MMP-3和TIMP-1的免疫组化阳性反应定位在软骨细胞及滑膜组织，呈棕红色（图 3）。在膝关节上，与溶剂对照组相比，ATRA低剂量组的ADAMT-4 和ATRA中剂量组的MMP-3 表达下调（P＜0.05），ATRA高剂量组的MMP-1 表达上调（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05）；在踝关节上，仅ATRA高剂量组的MMP-3高于溶剂对照组，其余各组蛋白表达与溶剂对照组差异无统计学意义（P＞0.05，表 4、5）。

图 3(Figure 3)

图 3 ATRA对大鼠蛋白表达的影响 Figure 3 Effect of ATRA on protein expression in the rats (×40).

表 4(Table 4)

表 4 对大鼠膝关节相关蛋白AOD值的影响 Table 4 Effects of ATRA on protein expressions (absorbance) of the rats' knee joint (n=8) Group ADAMT-4 MMP-1 MMP-3 TIMP-1 Solvent control group 0.10±0.005 0.087±0.003 0.11±0.005 0.16±0.007 ATRA low-dose group 0.09±0.007# 0.088±0.001 0.10±0.011 0.16±0.050 ATRA middle-dose group 0.10±0.010 0.087±0.001 0.096±0.001# 0.16±0.040 ATRA high-dose group 0.10±0.005 0.09±0.001# 0.11±0.005 0.16±0.006 #P＜0.05 vs solvent control group.

表 4 对大鼠膝关节相关蛋白AOD值的影响 Table 4 Effects of ATRA on protein expressions (absorbance) of the rats' knee joint (n=8)

表 5(Table 5)

表 5 对大鼠踝关节相关蛋白AOD值的影响 Table 5 Effects of ATRA on protein expressions (absorbance) of the rats' ankle joint (n=8) Group ADAMT-4 MMP-1 MMP-3 TIMP-1 Solvent control group 0.11±0.007 0.087±0.001 0.11±0.01 0.16±0.005 ATRA low-dose group 0.10±0.010 0.086±0.001 0.11±0.007 0.16±0.005 ATRA middle-dose group 0.10±0.060 0.087±0.002 0.11±0.012 0.16±0.004 ATRA high-dose group 0.10±0.007 0.087±0.001 0.13±0.012# 0.16±0.007 #P＜0.05 vs solvent control group.

表 5 对大鼠踝关节相关蛋白AOD值的影响 Table 5 Effects of ATRA on protein expressions (absorbance) of the rats' ankle joint (n=8)

CIA大鼠模型是应用最为广泛的一种RA动物模型，因为它具有很多人类RA的细胞和体液免疫特征^[13-14]。CIA大鼠模型通过软骨蛋白产生自身免疫反应，从而诱导关节炎的发生，产生抗CⅡ抗体。本实验通过CⅡ诱导成功建立了CIA 大鼠模型，通过在RA形成期使用ATRA对造模大鼠进行干预，探究ATRA对RA形成的预防作用及其机制。实验过程中，造模大鼠RA症状明显，多为后足，踝严重受累，前爪发病率较低，与Zhang等^[15]研究结果一致。虽各组出模率相同，但ATRA各剂量组大鼠各时点的AI值均低于溶剂对照组，出模较晚，提示出模前给予ATRA对RA症状有预防性的缓解作用。

CIA模型最初的病理变化依赖于特异性T细胞的CD4+表面抗原，T细胞活化及相关细胞因子的产生是RA的重要发病机制之一^[4]。研究表明，各种免疫细胞分泌的细胞因子如IL-17、IL-10、TNF-α等在RA形成过程中发挥着重要作用^[16]。IL-10 是公认的免疫抑制因子，在体内的来源主要是单核巨噬细胞、Th2 细胞和Foxp3+Treg 细胞，可以抑制巨噬细胞分泌IL-23，而IL-23在Th17介导的细胞免疫中起重要作用^[17]。IL-17是主要促炎效应因子，可以激活免疫淋巴T细胞和相关细胞。在动物实验中，IL-17 的相关抗体可明显缓解CIA鼠的关节炎症状，同时减轻骨组织的破坏，并且下调某些炎症因子的表达^[18]。TNF-α是RA发病机制中关键的促炎因子之一，主要由Th1细胞分泌，在RA滑膜增生、软骨/骨破坏和全身炎症反应中发挥重要作用^[19]。在本研究中，我们发现ATRA各剂量组IL-10的表达水平增加，IL-17A和TNF-α的表达水平减少，与溶剂对照组相比差异有统计学意义，表明预防性给予ATRA对CIA大鼠炎性症状的缓解作用可能与纠正CIA 大鼠血清Th1/Th2和Th17/Treg失衡有关。该结果与Kowk、Yuji等^[20-21]的研究结果基本一致，但有效剂量不同。我们发现，不同剂量对不同炎性因子的影响是有区别的，如ATRA低、高剂量组对IL-10、TNF-α的调节作用与溶剂对照组相比差异有统计学意义，而中剂量组差异无统计学意义，对IL-17A中、高剂量组却有明显下调作用。可能是因为ATRA对某些相关炎性因子具有双向性U形作用，而非常规线性量效关系，具体原因及机制尚不明确，还需进一步研究探讨。

在类风湿关节炎中，血管翳爬行、覆盖于关节软骨面，对软骨及骨造成进行性破坏^[22]。大量研究表明，ADAMTS和MMPs在RA的软骨基质降解导致骨质破坏过程中起着主要作用^[23-24]。ADAMTS-4在骨关节炎中的作用已被证实^[25]。在本研究中，由病理评分可以发现，在RA骨质破坏发展中，踝关节首先受累，且骨质破坏较膝关节严重。ATRA各剂量组ADAMT-4 的蛋白表达水平和溶剂对照组均明显上调，但在膝关节上，ATRA低剂量组较溶剂对照组有所下调，提示在RA骨质破坏早期，低剂量ATRA 可在一定程度上抑制ADAMTS-4 对蛋白聚糖的酶解作用。本研究结果显示，CIA大鼠MMP-3 的蛋白表达明显上调，但在膝关节，ATRA中剂量组MMP-3的蛋白表达较溶剂对照组有所下调，与前期研究结果一致^[10]，表明ATRA 对MMPs/TIMPs失衡有潜在的纠正作用倾向，但效果不明显。

综上所述，在胶原诱导关节炎形成期，ATRA促进IL-10 的分泌，并抑制TNF-α、IL-17A等促炎因子的分泌，可能在一定程度上纠正了Th1/Th2及Th17/Treg失衡，从而减轻CIA大鼠关节炎早期的炎症反应。