甲基苯丙胺（Methamphetamine, METH），又称去氧麻黄碱，是一种苯丙胺类中枢兴奋剂，可导致大脑出现与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）及肌萎缩侧索硬化（ALS）等神经退行性疾病相类似的改变^[1-2]，并且METH使用者患帕金森病的比率明显升高。近期研究还显示METH可以导致小鼠黑质纹状体区产生类似与Lewy小体的包涵体^[3-4]，METH还常被用于制作PD动物模型^[5-6]。二硫键异构酶（PDI）是一种与PD发病密切相关的蛋白，也是一种具有多种功能的内质网蛋白酶，并具有分子伴侣活性，在正常、无应激或一些温和的应激的神经元中，PDI可提供防御机制，有效抑制错误折叠蛋白的聚集，稳定蛋白质的正确结构^[7-8]；当过度的应激，诱导生成大量的NO时，NO则可使PDI发生S亚硝基化，而失去原有的正常功能，最终导致异常蛋白聚集和神经细胞损伤或死亡^[9-11]。因此，在散在的PD与AD患者的脑组织样本中，大量的NO导致PDI明显被S-亚硝基化，细胞内Lewy小体大量聚集，最终多巴胺能神经元减少或死亡。在前期实验中，我们已经证明METH可使神经元内氧化应激作用显著增强，NO的表达显著升高，而METH诱导升高的NO是否也和退行性疾病诱导升高的NO一样，导致细胞内PDI发生S-亚硝基化而其失去其保护的功能，这还不得而知，因此为了证明METH所致的氧化应激与PDI的关系，我们利用METH处理PC12细胞，并且检测PC12细胞中PDI的S亚硝基化的情况，从而为治疗METH导致的神经毒性提供重要靶点。

高分化的PC12细胞购自中科院上海细胞库，盐酸甲基苯丙胺购自中国药品生物制品鉴定所，DEME培养基、胎牛血清购自Gibco公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）、streptavidinagarose、购自Sigma公司，Biotion-HPDP购自pierce公司，兔抗鼠PDI多克隆抗体购自Cell signaling technology公司，PVDF膜购自Millopore公司，其余试剂为国产分析纯试剂。

高分化的PC12细胞培养于含有10%FBS的高糖DMEM培养基中，37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，隔天换液，每2~3 d传代1次。根据实验需求将细胞种植于96孔板、6孔板、小皿爬片中，当PC12细胞培养至对数生长期，达约70%汇合时进行实验。将细胞分为2大组，每1大组中又各分为5小组。第1大组为METH组，分别用0、0.5、1、2、3 mmol/L 5种不同浓度的METH处理细胞；第2大组为METH+ L-NNA组，预先用0.1 mmol/L的L-NNA处理各组细胞30 min，再分别用0、0.5、1、2、3 mmol/L 5种不同浓度的METH处理细胞。药物处理24 h后，收集细胞，检测指标。

CCK-8法检测METH组细胞的存活率；Western Blotting法检测METH组和METH + L-NNA组中细胞内PDI总蛋白的表达变化，生物素转化法检测METH组和METH + L-NNA组细胞内PDI-SNO的表达变化^[9]，并根据PDI-SNO表达率变化情况，找出最适METH浓度，CCK-8法和HE染色法比较在此最适浓度下，对应的METH组细胞与METH+ L-NNA组细胞存活率和细胞形态学变化情况，并且以METH浓度为0时所对应的METH组和METH + L-NNA组为对照。

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差表示；多组数据间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

CCK-8法测得PC12细胞存活率随METH浓度升高而逐渐降低，除0.5 mmol/L METH组外（P>0.05），其他各浓度组与浓度为0的METH组相比均有统计学差异（P < 0.05），且各两组间比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。表明METH具有神经毒性，可使神经元细胞存活率显著降低，且降低程度与METH浓度成正相关（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 METH对PC12细胞存活率的影响 Figure 1 Effect of METH on the viability of PC12 cells. *P < 0.05 vs 0 mmol METH group.

生物素转化法测得METH可导致PC12细胞内PDI发生显著S亚硝基化，且随着METH的浓度升高，PDI的S亚硝基化程度越大，当METH浓度大于2 mmol/L时，PDI的S亚硝基化，较浓度为0的METH组具有统计学差异（P < 0.05）。0.1 mmol/L的一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NNA可有效抑制PDI的S亚硝基化，当METH浓度大于2 mmol/L时，L-NNA抑制PDI的S亚硝基化具有统计学意义（P < 0.05），且当METH的浓度在3 mmol/L时，L-NNA抑制PDI的S亚硝基化效果最为最显著（P < 0.01），因此在下一步的实验中，我们选用3 mmol/L的METH浓度（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 METH组和METH+L-NNA组细胞内PDI-SNO表达率情况 Figure 2 S-nitrosylation of PDI levels in METH and METH + L-NNA groups. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 mmol METH group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs METH group of the same concentration.

CCK-8法测得0 mmol/L的METH组与0 mmol/L的METH+L-NNA组细胞存活率没有统计学差异（P> 0.05），说明L-NNA本身对细胞无毒性作用；而3 mmol/L的METH+L-NNA组细胞存活率较3 mmol/L的METH组显著升高（P < 0.05），说明NOS抑制剂L-NNA在一定程度上可有效的抑制METH所致的细胞存活率的下降（图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 L-NNA对METH所致的细胞存活率的影响 Figure 3 Effect of L-NNA on METH-induced reduction in cell viability (*P < 0.05 vs 3 mmol METH group).

将细胞经过HE染色后，显微镜下观察各组细胞均表现为核嗜碱性、胞质嗜酸性，核蓝浆红的状态。其中0 mmol/L的METH组PC12细胞胞膜光滑边界清晰，胞体呈长梭形，有多条细长突起伸出，并相互延伸连接形成类似神经元的网状结构；0 mmol/L的METH+L-NNA组细胞形态与0 mmol/L的METH组相类似，细胞生长良好，无异常；3 mmol/L的METH组PC12细胞胞体萎缩变圆，细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，胞核聚集成团。3 mmol/L的METH+L-NNA组细胞形态损伤较METH组降低，可见胞体皱缩、胞质嗜酸性、胞核聚集成团等异常变化都有所缓解。说明NOS抑制剂L-NNA可在一定程度上抑制METH所致的细胞形态的改变（图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 L-NNA对METH所致的细胞形态学的影响 Figure 4 Effect of L-NNA on METH-induced changes in cell morphology.

目前，国内外关于METH的神经毒性机制的研究仍处于探索阶段，其中氧化应激一直是METH所致神经毒性机制重点研究对象之一^[12]。在前期实验中，我们已经发现METH可通过诱导大鼠脑组织中的氧化应激作用，使大鼠脑组织中的NO表达显著升高，且神经毒性也随之增强^[13]。但诱导产生的NO所致的神经毒性机制仍不明确。为进一步对METH诱导的氧化应激作用所致的神经毒性进行深入研究，我们对神经元中与氧化应激相关的重要蛋白进行分析，通过查找文献发现，PDI不仅是内质网中含量非常高的一种蛋白，同时也是生物功能非常重要的一种蛋白，它不仅具有氧化、还原和异构等多种功能，同时还具有分子伴侣活性，能抑制错误折叠蛋白的聚集，稳定蛋白质的正确结构，在一些神经退行性疾病中起到非常重要的作用^[14-17]。然而在一些神经退行性疾病中，PDI易受氧化应激作用的影响，与氧化应激产生的NO结合，形成S亚硝基化PDI，从而导致PDI的构象发生改变，其原有的氧化、还原、异构以及分子伴侣等功能受损^[18-20]。早在2006年，Uehara等^[21]研究发现PDI及PDI-SNO在蛋白质异常聚集相关神经系统变性疾病中具有重要地位，与AD和PD等退行性疾病的发病机制密不可分，在这些退行性疾病的脑组织样本中，PDI明显被S-亚硝基化。有文献研究表明当用小剂量的METH处理多巴胺能神经元时，PDI家族成员中的PDIA3未发生显著的S亚硝基化，且细胞也没有出现明显的毒性损伤，当抑制细胞内PDIA3的表达之后，再用小剂量的METH处理时，细胞出现明显的损伤作用，说明PDIA3在METH导致的神经毒性中确实起到一定的保护作用^[22]，同时也预示着PDI家族与METH所致的神经毒性密切相关。

我们利用较高剂量的METH处理PC12细胞，使得PC12细胞中的PDI与METH诱导的氧化应激产生的NO结合，形成PDI-SNO，失去其正常功能，而不再具有抵抗METH所致的神经毒性作用。细胞内NO的生物合成是通过酶促反应进行的。L-精氨酸在NOS的催化下，以及一系列的辅助因子的作用下，先生成左旋羟基精氨酸，再最后生成NO。其中NOS是NO生成的关键因素。神经系统中的NOS主要存在于神经元中，而神经元中的NOS根据其酶的来源不同、对钙离子依赖性的不同以及是否受内毒素诱导等特点分为神经元型（nNOS）、内皮型（iNOS）和诱导型（eNOS）3种不同的NOS。L-NNA是一种经典的NOS抑制剂，它是L-精氨酸的类似物，可与L-精氨酸发生竞争性抑制，是非选择性NOS抑制剂，可有效抑制神经元中这3种不同类型NOS。因此在我们实验中，当用NOS抑制剂L-NNA预处理细胞时，L-NNA可通过抑制METH所致的NOS表达，从而降低细胞内NO的表达，进而显著降低METH所致的PDI-SNO程度，那么正常功能的PDI则可保护神经元，改善METH所致的神经毒性，提高细胞的存活率。这些结果证明METH所致的神经毒性确实与PDI功能异常有关。PDI是一种抑制错误折叠蛋白聚集、稳定蛋白质正确结构的重要的酶，因此有可能METH所致的PDI的S亚硝基化，导致PDI失去原有功能，致使细胞内某些蛋白结构异常，或异常聚集，而产生神经毒性；当抑制PDI的亚硝基化时，PDI的功能未受到影响，从而可保证神经元内某些蛋白的正常结构和活性，抑制METH所致的神经毒性。而该蛋白是什么蛋白，如何发生聚集还不得而知。因此，研究工作是找出PDI所保护的蛋白，重点研究该蛋白通过何种机制保护神经元、抑制METH的神经毒性，并以此蛋白作为研究靶点，为治疗METH神经毒性提供新的理论依据。