蛋白尿是肾脏疾病主要的临床表现之一，也是肾脏病持续性进展的重要指标.糖皮质激素作为临床常用抗蛋白尿药物的机制尚不明确，以往认为是通过抗炎和免疫调节发挥抗蛋白尿作用，现研究表明，肾脏足细胞存在糖皮质激素的功能受体^[1]而起到保护作用.近几年从分子水平的研究，发现多种信号传导通路对足细胞的生长、表型转化、凋亡、自噬^[2]等起着重要的调控作用.PI3K/Akt信号通路是介导细胞存活的一条经典信号通路，广泛存在于真核细胞内，在人类的生理功能中起关键作用，涉及细胞生长、存活的众多过程^[3-5].研究表明PI3K/Akt信号通路在成纤维细胞、听毛细胞及肾小管上皮细胞^[6]等损伤中发挥重要保护作用.Xavier等^[7]发现肾脏的足细胞分子CD2AP参与Tbeta RI 与PI3K调节亚基p85之间的相互作用，激活PI3K/Akt的信号通路抗Tbeta诱导的足细胞凋亡.Wada等^[8]研究发现地塞米松（DEX）是通过下调P53，上调Bcl-xL和抑制AIF 的转移而抑制足细胞的凋亡.我们前期的研究^[9]也表明PI3K/Akt信号通路在抗足细胞凋亡中起着重要的作用，且发现DEX能抑制嘌呤霉素（PAN）致足细胞损伤的作用.以往的研究在体外阐明DEX通过PI3K/Akt信号通路与细胞的关系；但在活体动物体内，DEX是否通过PI3K/Akt信号传导通路降低蛋白尿的相关性尚未见报道.本实验通过活体阿霉素（ADR）大鼠肾病模型探讨受DEX及LY294002（PI3K抑制剂）影响下，PI3K/Akt信号通路的蛋白激酶（Akt）磷酸化的状况、下游分子凋亡蛋白Bad、Bad-mRNA的表达与尿蛋白变化的相关性及其意义.

SPF级动物，雄性SD大鼠（购于中山大学实验动物中心）6~8周龄，24只；应用随机数表法分为正常对照组（NC组）；阿霉素肾病组（ADR组）；阿霉素+地塞米松治疗组（DEX组）；阿霉素+地塞米松+LY294002 干预组（LY294002 组）.动物饲养于中山大学实验动物中心[设施合格证：SYXK（粤）2011-0112].

适应饲养1周后，ADR组，DEX组，LY294002组接受尾静脉注射5 mg/kg ADR（D107159-25mg阿拉丁，中国）；NC组注射等量生理盐水.地塞米松干预：ADR注射后第7 天和第14 天，按剂量1 mg/kg 对DEX组及LY294002 组行地塞米松（D4902，sigma，美国）溶液腹腔注射；NC 组、ADR 组接受等量0.1% DMSO 溶剂（D4540，sigma，美国）腹腔注射.LY294002干预：ADR注射后第7天和第14天，LY294002组接受尾静脉注射LY294002（L9908，sigma，美国）0.3 mg/kg；NC组、ADR组与DEX组接受等量0.1% DMSO溶剂尾静脉注射.ADR注射后第7、14、28天采集动物24 h尿液.ADR注射后第28天处死动物摘取肾脏.

ADR注射后第7、14、28天，代谢笼收集24 h尿液（BFSS19981大鼠代谢笼南京便诊生物科技有限公司）.采用Bradford方法检测24 h尿蛋白（Bradford蛋白定量试剂盒购于广州永诺生物科技有限公司）:按照试剂盒说明书操作，采用DR-200BS多功能酶标仪（无锡华卫德郎仪器有限公司）检测样本595 nm吸光度，计算尿蛋白含量.

每组各用2 mL EP 管称取约100 mg的肾皮质部分组织物，用4 ℃预冷的PBS洗去血迹，加入700 μL的4 ℃预冷的PBS；剪碎组织物，电动离心，吸弃PBS，重复3次；加入300 μL RIPA，匀浆5~8 min，12 000 r/min，4 ℃离心30 min；离心结束后取中间层液体（蛋白液）至新的已标记好的2 mL EP管，记录样品量，-80 ℃冰箱保存备用.

每个样本每孔加入50 μg蛋白液行聚丙烯酰胺凝胶电泳（积层胶电泳：95 V，40 min；分离胶电泳：200 V，120 min），湿转至硝酸纤维膜上（250 mA，1 h），以5%脱脂奶粉封闭，加稀释一抗（p-AKT，AKT，Bad，GAPDH均购自Cell Signaling Technology）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤7 min×2，然后加稀释二抗（购自Jackson）室温下摇床孵育60 min，经TBST洗涤7 min×3后加入ECL发光液（购自广州永诺生物科技有限公司），避光反应5 min，化学成像系统上曝光显影，用Image J分析目标条带的光密度值，采用GAPDH作为内参，用Image Tool软件进行定量分析.

用Invitrogen公司的Trizol试剂盒，按试剂盒提供程序提取肾皮质总RNA.20 μL 逆转录反应体系含有5 μg 总RNA，0.1 μg的随机引物，200 U的M-MLV（Invitrogen），用黑马9600型PCR仪37 ℃，60 min；95 ℃，3 min反应条件循环1次得到cDNA.50 μL的QPCR反应体系含有5 μL逆转录产物，10 μL 5×SYBR Green 1 buffer，l μL10 mmol/L dNTPs（Promega），25 μmol/L的上、下游引物各l μL（广州锐博生物设计的引物），5UTaqDNA聚合酶（Promega）.用Bio-RAD MJ mini 型荧光PCR仪（Bio-RAD）进行实时荧光定量PCR反应.

用SPSS17统计软件，对各组间的数值进行方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义.

第7、14天ADR组、DEX组、LY294002组蛋白尿不同程度增加，ADR 组、LY294002 组与NC 组比对P＜0.05，差异有统计学意义，而DEX组与NC组比对P＞0.05，差异无统计学意义；第28 天ADR 组、DEX 组、LY294002组蛋白尿与NC组相互比对均为P＜0.05差异有统计学意义；LY294002组与DEX组比对P＜0.05，差异有统计学意义（表 1）.

表 1(Table 1)

表 1 各组各时间点24 h尿蛋白总量 Table 1 Total urine protein in 24-h urine collected at different time points in the groups (mg/24 h, Mean±SD, n=6) Group 7thday 14thday 28thday NC group 8.12±0.92 9.48±0.93 10.85±0.57 ADR group 14.58±0.69a 38.41±1.75a 71.52±3.79ade DEX group 10.34±0.81c 16.35±2.17c 28.44±2.48d LY294002 group 14.22±1.94b 39.45±4.23b 68.73±3.94bde aP＜0.05 vs NC group; bP＜0.05 vs NC group; cP＞0.05 vs NC group; dP＜0.05 vs NC group, eP＜0.05 vs DEX group

表 1 各组各时间点24 h尿蛋白总量 Table 1 Total urine protein in 24-h urine collected at different time points in the groups (mg/24 h, Mean±SD, n=6)

ADR组的p-AKT/AkT 下降，Bad 蛋白表达升高，与NC组比对P＜0.05，有统计学差异；DEX组的p-AKT/AkT升高，Bad蛋白表达下降，与NC组比对P＞0.05，无统计学差异；LY294002 组的p-AKT/AkT下降，Bad 蛋白的表达亦升高，与NC组比对P＜0.05，有统计学差异.另外，LY294002 组与DEX组的p-AKT/AkT、Bad蛋白表达相互比对P＜0.05有统计学差异（图 1）.

图 1(Figure 1)

图 1 各组大鼠肾组织p-AKT、AKT和Bad蛋白的表达变化 Figure 1 Expression of p-AKT, AKT and Bad proteins detected by Western blotting (A) and quantitative analysis of p-AKT/ AKT ratio (B) and Bad protein expression (C) in rat kidney tissues in different groups. *P＜0.05 vs NC group; &P＞0.05 NC group; #P＞0.05 vs DEX group

ADR组的Bad-mRNA表达升高，与NC组比对P＜0.05，有统计学差异；DEX组的Bad-mRNA表达下降，与NC组比对P＞0.05，无统计学差异；LY294002 组的Bad-mRNA表达亦升高，与NC组比对P＜0.05，有统计学差异；LY294002 组与DEX组的Bad-mRNA表达差异P＜0.05，有统计学差异（图 2）.

图 2(Figure 2)

图 2 各组大鼠肾组织Bad-mRNA的表达变化 Figure 2 Expression of Bad mRNA in rat kidney tissues detected by qRT-PCR. *P＜0.05 vs NC group; &P＞0.05 vs NC group; #P＞0.05 vs DEX group

研究发现PI3K/Akt 信号通路通过磷酸化多种底物，促进细胞生长、增殖，抑制细胞凋亡^[10]，Akt 作为PI3K的重要下游靶激酶，磷酸化Akt（p-AKT）是必要的条件^[11].Woroniecki等^[12]发现正常足细胞受信号分子刺激后，PI3K很快被磷酸化而起到保护细胞作用.另发现PAN刺激后CD2AP的表达下降，Akt磷酸化率下降，抑制了PI3K/Akt信号通路致足细胞凋亡率显着升高^[9].又有研究发现PI3K/Akt信号传导通路下游存在多种转录因子而抑制凋亡基因的表达（FKHRLl）和增强抗凋亡基因的表达（NF-κB和Bcl-2）以及直接磷酸化促凋亡蛋白Bad、caspase-9使其失活从而中断下游信号^[13].其中凋亡蛋白Bad （bcl-xl/bcl-2 associated deathpromoter）是PI3K/Akt 信号通路的主要下游作用靶蛋白，Bad蛋白在外周及中枢神经元、淋巴细胞、骨髓造血细胞、生殖细胞及许多上皮细胞中均有表达并参与细胞凋亡机制^[14-15].生理状态下Bad蛋白以磷酸化状态存在，稳定发挥抗凋亡效应，而去磷酸化的游离Bad蛋白通过易位和一系列细胞活动促进细胞凋亡发生^[16].本实验中，观察到ADR组大鼠p-AKT/AkT的比值降低，Bad-mRNA、Bad 蛋白的表达水平均升高；24 h尿蛋白总量明增加，尿蛋白总量的结果与蒋罗等^[17]结果相似，我们认为p-AKT降低，是ADR抑制了PI3K/Akt信号通路的磷酸化，下游表达产物Bad-mRNA、Bad蛋白表达升高，推测其促进了肾小球的足细胞凋亡，产生尿蛋白.同时也显示本实验ADR大鼠肾病造模是成功的.

肾上腺皮质激素作为临床使用的一线治疗药物，对减轻肾病蛋白尿已得到临床认可但其作用机制尚不明晰，以往认为主要通过抗炎和免疫调节发挥作用，有研究表明足细胞存在糖皮质激素的功能受体^[18]，DEX可直接作用于足细胞，稳定足细胞分子CD2AP的表达和分布，使CD2AP与PI3K调节亚基p85相互作用，激活PI3K/Akt 信号通路，升高GSK3p 磷酸化水平，降低GSK3B活性，下调下游靶蛋白Bad-mRNA和Bad的表达，修复受损足细胞，起到抗足细胞凋亡的作用^[19-20].本研究在DEX组，p-AKT/AkT 增加，Bad-mRNA 及Bad蛋白表达水平下降，与上述的研究相吻合；在此实验中，发现第1、2 周尿蛋白与NC组比对明显减少，可表明DEX在活体ADR大鼠中有可能通过PI3K/Akt信号通路减少ADR肾病模型的尿蛋白.另一结果显示，本组的尿蛋白在第4周明显增加，与陈小英等^[21]的结果略有差异，此结果我们认为DEX 对ADR大鼠肾病模型只能缓解而非“治愈”.

有报道LY294002是PI3K/Akt信号通路特异性阻断剂^[22]，LY294002在上游非特异性阻断PI3K/Akt信号通路，导致Akt磷酸化水平降低，细胞周期阻滞、凋亡增加^[23]；本实验的LY294002组结果显示与ADR组相似，p-AKT/AkT下降、Bad-mRNA表达水平增加，下游产物Bad 蛋白表达升高，尿蛋白增加.我们认为，因为LY294002 阻断了PI3K/Akt 信号通路，使DEX 失去PI3K/Akt信号通路激活作用，由此可见，PI3K/Akt信号通路是DEX减少尿蛋白的信号传导机制之一.

综上所述，本研究各组大鼠的PI3K/Akt信号传导通路下游蛋白的表达和尿蛋白的变化说明，DEX通过激活PI3K/Akt信号通路，下调其下游分子Bad-mRNA、Bad的表达，减少阿霉素肾病大鼠的尿蛋白，LY294002可抑制该信号通路从而阻断DEX减少尿蛋白的作用，从而表明PI3K/Akt 信号通路是DEX减少尿蛋白的信号传导机制之一.结合以往的研究，该通路有可能成为保护足细胞，治疗蛋白尿的理想治疗靶点之一.