2016, Vol. 36
2. 蚌埠医学院 生物科学系，安徽 蚌埠 233030
2. Department of Biological Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China
心血管疾病威胁着人类的生命健康，再灌注疗法改善了心脏功能，取得了很好的疗效，也引起了新问题--缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤.研究I/R损伤的相关机制，有助于防治临床心肌损伤的发生，Rho激酶和自噬都参与了心肌I/R损伤.Rho激酶是一类丝-苏氨酸蛋白家族，抑制Rho激酶可以起到抗心肌缺血/再灌注损伤作用[1-2].自噬是现阶段的各种疾病机制的研究热点，早期认为自噬是进化过程中高度保守的、在溶酶体内降解细胞质成分的正常生理过程，除维持生理机体稳态功能外，近年来相继报道自噬功能的失调还与衰老、神经退行性病变、心血管疾病等相关[3-4]，自噬在心肌I/R损伤中的作用存在争议，一方面认为自噬增强可能导致细胞死亡，加重心肌I/R损伤[5]，另一方面却认为自噬在I/R损伤中起着有益的作用[6-7].因此，尽管多种研究表明自噬参与心肌I/R损伤，但自噬的作用仍无定论.有研究表明Rho激酶与自噬之间存在一定的联系[8]，但在法舒地尔抑制Rho激酶对抗心肌I/R损伤中，自噬如何发生，发挥何种作用尚未见报道，尽早明确自噬的作用及可能机制可为减轻心肌I/R损伤提供治疗新途径.本研究通过复制离体大鼠心肌I/R损伤模型，观察抑制Rho激酶心肌保护作用的同时，检测自噬相关基因Atg5、Beclin1 mRNA表达的变化，以明确自噬是否参与抑制Rho激酶的心肌保护；应用自噬抑制剂进一步探讨自噬在法舒地尔心肌保护中的作用，并观察凋亡相关因子的改变，分析自噬与凋亡的发生在心肌保护作用中的关联.
1 材料和方法 1.1 实验动物和材料健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，SPF级，体质量220~250 g，共24只，由蚌埠医学院实验动物中心提供.川威（盐酸法舒地尔注射液），Rho激酶抑制剂，购自天津红日药业股份有限公司.自噬抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin，Wort）购自于Sigma 公司.改良Krebs-Henseleit（K-H）液成分：NaCl 118 mmol/L，KCl4.7mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，NaHCO3 25mmol/L，Glucose 11mmol/L，pH 7.3~7.4.Trizol总RNA提取试剂购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自Fermentas公司；引物合成于上海生工生物工程技术服务有限公司，Atg5引物：上游序列5'-AGT GGA GGC AAC AGAACC-3'，下游序列5'-GAC ACG AAC TGG CAC ATT-3'，预计扩增产物长度205 bp；Beclin1 引物：上游序列5'-GAGCCA TTT ATT GAA ACT CGC CA-3'，下游序列5'-CCT CCC CGA TCA GAG TGAA-3'，预计扩增产物长度为106 bp；Bax引物：上游序列5'-GGA TCG AGCAGA GAG GAT GG-3'，下游序列5'-TGG TGA GTGAGG CAG TGA GG-3'，预计扩增产物长度464 bp；Bcl-2 引物：上游序列5'-CTG GTG GAC AAC ATCGCT CTG-3'，下游序列5'-GGT CTG CTG ACC TCACTTGTG-3'，预计扩增产物长度228 bp；以β-actin为内参照，引物上游序列5'-CTG TAT GCC TCT GGT CGTAC-3'，下游序列5'-TGA TGT CAC GCA CGA TTTCC-3'，预计扩增产物长度214 bp.一抗小鼠抗大鼠β-actin 抗体、兔抗大鼠caspase 3 抗体均购自CellSignaling Technology公司，二抗HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗小鼠Ig G均购自Affinity公司.
1.2 离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型制备及分组4%水合氯醛麻醉大鼠，断头器上断头，开胸迅速取心脏置冰水停搏，Langendorff装置上行主动脉干逆行灌流.K-H 液恒压（76 mmHg）灌流，以95% O2+5%CO2饱和，维持灌流液温度37 ℃恒温.切开左心耳将乳胶囊插入至左心室，囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，Medlab 生物信号采集处理系统记录实验结果.待心脏稳定25 min后，进行实验干预.将大鼠随机分3组，每组8 只：（1）缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤组：将大鼠冠状动脉左前降支结扎30 min复制局部心肌缺血，随之解开结扎线灌流120 min作为单纯I/R；（2）Fasudil组：同I/R组，期间（缺血前10 min至再灌注初期10 min）给予法舒地尔30 μmol/L，共灌流50 min；（3）Fasudil+Wort组：同I/R组，期间（同上）同时给予法舒地尔30 μmol/L+渥曼青霉素100 nmol/L，共灌流50 min.
1.3 左心室功能指标向乳胶囊注水调整左心室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）维持在4~10 mmHg，Medlab生物信号采集处理系统记录左心室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）、LVEDP和左心室内压最大上升和下降速率（maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax），计算左心室做功量（rate pressure product，RPP），RPP=LVDP×HR[9].
1.4 离体心脏冠脉流出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量测定再灌注第5 min和第10 min收集冠脉流出液，分光光度法测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）的含量，单位以U/L表示.
1.5 RT-PCR 检测Atg5、Beclin1、Bax 和Bcl-2 mRNA表达利用Trizol 总RNA提取试剂提取左心室组织总RNA，取总RNA 3 μL 作模板，逆转录试剂盒合成cDNA，PCR 试剂盒取1.5 μL cDNA 为模板，进行扩增.扩增条件：95 ℃预变性3 min后，以（1）95 ℃ 30 s变性；（2）Atg5 退火温度56 ℃ 30 s，Beclin1 退火温度57 ℃ 30 s，Bax 退火温度64.5 ℃ 30 s，Bcl-2 退火温度61.5 ℃ 30 s，β-actin退火温度58℃ 30 s；（3）72 ℃ 35 s，循环数为30，最后一轮延伸10 min.取4 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭显色.GIS凝胶图像处理系统拍摄记录，图像分析软件扫描泳带净光密度值作半定量分析，以目的基因与内参的净光密度比值（Atg5/β-actin；Beclin1/β-actin；Bcl-2/β-actin；Bax/β-actin）表示mRNA相对表达量，并计算Bcl-2/Bax比值.
1.6 Western blotting检测心肌组织caspase 3的表达收集再灌后心肌组织，试剂盒提取蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度.配制6%~15% SDS聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离蛋白，然后200 mA将蛋白转至PVDF膜上.室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，用相应的I抗（1∶1000）4 ℃孵育膜过夜，洗涤后换HRP标记II抗室温孵育2 h.洗涤后采用化学发光试剂盒在CE Image Quant LAS 4000 mini超灵敏化学发光成像仪显影，使用Image J的软件分析条带灰度值.
1.7 统计分析实验数据以均数±标准差表示.各组间数据显着性检验采用单因素方差（One-way ANOVA）分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为有统计学意义.
2 结果 2.1 左心室功能改变单纯I/R组大鼠心脏缺血与复灌期间LVDP降低，LVEDP上抬，±dp/dtmax降低，RPP降低；与单纯I/R组相比，Fasudil 组LVDP和±dp/dtmax 得到恢复，LVEDP降低，RPP增加；与Fasudil组相比，自噬抑制剂Wort干预后LVDP、±dp/dtmax和RPP均降低，再灌期间LVED明显升高，提示抑制自噬减弱了法舒地尔的作用（表 1）.
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表 1 离体大鼠心脏动力学指标 Table 1 Hemodynamic parameters of the isolated rat heart (Mean±SD, n=8) |
与单纯I/R相比，Fasudil使复灌不同时间点大鼠心脏冠脉流出液中LDH 释放减少；与Fasudil 组相比，Fasudil+Wort组LDH释放增加（图 1）.
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图 1 心脏冠脉流出液中乳酸脱氢酶含量 Figure 1 LDH content in the coronary effluent in different groups (n=8, U/L, Mean±SD). **P＜0.01 vs I/R group; ##P＜0.01 vs Fasudil group. |
单纯I/R组自噬相关基因Atg5和Beclin1和凋亡相关因子Bcl-2和Bax mRNA均有表达，提示自噬和凋亡均参与心肌I/R损伤；与单纯I/R组相比，Fasudil组Atg5和Beclin1 mRNA表达增加，抑制凋亡因子Bcl-2表达增加，Bcl-2/Bax比值增高；与Fasudil组比较，Fasudil+Wort组Atg5和Beclin1 mRNA表达减少，Bcl-2/Bax比值降低（表 2，图 2，图 3）.
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表 2 各组心肌组织中Atg5、Beclin1、Bcl-2和Bax mRNA表达 Table 2 Atg5, Beclin1,Bcl-2 and Bax mRNA expressions in myocardial tissue and the ratio of Bcl-2/Bax in different groups (Mean±SD, n=8) |
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图 2 各组心肌组织中Atg5和Beclin1 mRNA琼脂糖凝胶电泳 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of Atg5 and Beclin1 mRNA in different groups. 1: I/R group; 2: Fasudil group; 3: Fasudil+Wort group; 4: Marker |
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图 3 各组心肌组织中Bcl-2和Bax mRNA琼脂糖凝胶电泳 Figure 3 Agarose gel electrophoresis of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA in different groups. 1: I/R group; 2: Fasudil group; 3: Fasudil+Wort group; 4: Marker |
与单纯I/R组相比，Fasudil组caspase 3蛋白表达降低；与Fasudil组比较，Fasudil+Wort组caspase 3蛋白表达升高（图 4，表 3）.
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图 4 各组心肌组织中caspase 3蛋白表达 Figure 4 Caspase 3 protein expression in rat myocardial tissue in different groups. 1: I/R group; 2: Fasudil group; 3: Fasudil+Wort group |
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表 3 各组心肌组织中caspase 3蛋白表达平均灰度值 Table 3 Caspase 3 protein expression average grey value in rat myocardial tissue of different groups (Mean±SD, n=8) |
心血管疾病的再灌注疗法带来新的问题--缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤，钙超载、氧化应激、中性粒细胞学说等现已得到公认，但其发生机制还需进一步阐明.Rho激酶在I/R损伤中起到很重要的作用，抑制Rho激酶可以激活PI3K/Akt信号通路保护心脏[10-11]；我们前期的研究显示法舒地尔能够抑制Rho激酶信号通路发挥心肌保护作用，其机制可能与激动ALDH2、抑制细胞凋亡发生有关[12]，可见Rho激酶可能通过不同机制参与了心肌I/R损伤，其中是否有自噬的参与、自噬发挥何种作用以及相关机制未见报道，还需进一步探讨.
本研究应用Langendorff装置复制心肌I/R损伤模型，检测大鼠心肌缺血再灌注不同时间点心肌动力学改变，LVDP、+dp/dtmax反映心肌收缩功能；LVDEP、-dp/dtmax 反映心肌的舒张功能[13].实验结果显示，与I/R组相比，Rho激酶抑制剂Fasudil组大鼠心肌再灌注期间各时间点LVDP、±dp/dtmax 及RPP升高，抑制LVEDP的升高，说明Fasudil抑制Rho激酶后，心脏再灌注后收缩和舒张机能得到改善.
乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，早期血清中LDH的升高见于急性心肌梗塞发作后，临床上常作为诊断急性心梗的标准之一；I/R损伤时细胞膜通透性增加，LDH释放增多，因此可将冠脉流出液中LDH含量作为判断受损的指标[14].实验中观察到Fasudil抑制Rho激酶后降低了心肌再灌注期间LDH的释放，说明Fasudil 抑制Rho激酶后减轻I/R损伤.
细胞死亡分为坏死、凋亡和自噬.凋亡和自噬的均参与I/R损伤[15].抑制Rho激酶的心肌保护作用与降低细胞凋亡相关[1]，那么自噬是否亦参与其中呢？我们检测了自噬相关基因Atg5和Beclin1 mRNA的表达.哺乳动物的自噬相关基因Beclin1是酵母自噬基因Apg6/Vps30的同源物，是自噬重要的正调节因子，常作为自噬的定量检测的重要指标[16].Atg5是参与自噬调控的重要基因，Atg5 与Atg12 复合物定位于自噬体膜的表面，促进自噬体膜的伸展扩张，诱导自噬体的形成，是自噬体形成所必须的重要因素[17-18].结果显示Fasudil组Atg5和Beclin1 mRNA表达增加，提示Fasudil抑制Rho激酶抗心肌I/R损伤作用中诱导了自噬的发生.进一步应用自噬抑制剂渥曼青霉素发现，自噬减弱的同时Fasudil 的抗心肌I/R 损伤作用减弱，提示Fasudil 抑制Rho激酶后可能通过诱导自噬的发生发挥心肌保护作用.
I/R损伤中凋亡和自噬共同参与，且两者间存在一定联系.HL-1心肌细胞研究中发现，下调自噬相关基因Beclin1或Atg5抑制自噬发生，同时也使I/R损伤诱导的细胞凋亡增加，而过表达Beclin1增强自噬，则使细胞凋亡发生率降低[19].肝脏的缺血预处理上调小鼠体内自噬和凋亡的关键因素之一-血红素氧合酶1，通过p38-MAPK信号通路诱导自噬，然后吞噬受损的线粒体抑制细胞凋亡，最终保护肝细胞免受I/R损伤[20].那么抑制Rho激酶后，自噬与凋亡是何种关系呢？我们进一步检测caspase 3蛋白表达和Bcl-2和Bax mRNA的表达.Caspase 3，属于效应caspase蛋白，位于细胞凋亡有序级联反应的下游，是最为重要的凋亡执行者、多种凋亡刺激信号的汇聚点，被激活后促进细胞凋亡.Bax与线粒体渗透性转换孔蛋白结合促进细胞色素C从线粒体释放入细胞诱发细胞凋亡，Bcl-2则可抑制Bax移位到线粒体膜上，从而抑制凋亡.可见Bcl-2、Bax 和caspase 3均为参与细胞凋亡的重要分子[21-23].实验结果显示Fasudil 抑制Rho 激酶诱导自噬发生的同时，caspase 3蛋白表达降低，Bcl-2/Bax比值增高，细胞凋亡减弱；自噬抑制剂渥曼青霉干预后，自噬降低的同时caspase 3蛋白表达增加，Bcl-2/Bax比值降低，细胞凋亡增加，提示抑制Rho激酶后诱导自噬的发生，可减轻细胞凋亡.
综上所述，离体大鼠心肌I/R 损伤模型中，在Fasudil抑制Rho激酶对抗心肌损伤而保护心肌中可能诱导了自噬的发生，自噬的发生影响了细胞凋亡，使凋亡降低.但是抑制Rho激酶通过何种途径诱导自噬的发生，以及自噬和凋亡相互作用的具体机制还需阐明，这也是我们下一步的研究工作.
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