肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤，我国是原发性肝癌的高发国家，2015年新发HCC病例数达46.6万，在所有新发肿瘤中，仅次于肺癌、胃癌和食道癌，排第4位^[1]。肿瘤发生率存在性别差异是HCC一个显著的流行病学特点，HCC多发于男性，男女比例在国内为2.8~6.4:1，同时女性患者通常肿瘤结节数较少，肿瘤较小，且较少出现血管浸润，患者预后较好，存活时间较男性HCC 患者延长^[1-2]。

Naugler 等^[3]的研究显示雌激素可抑制Kupffer 细胞产生白介素-6，抑制STAT3 信号通路的活化与女性患者HCC发生风险降低有关, 而且切除卵巢后化学药物诱导大鼠HCC成瘤率和肺转移率增高、肝肿瘤平均直径明显增大^[4]。研究还显示HCC患者血清雌激素水平较低，肝癌组织中雌激素受体表达与肿瘤的分期有关^[5-7]，而且雌激素可通过与其受体结合抑制NF-KB活性，从而控制肿瘤的生长^{[6, 8]}。

近年来虽然HCC的治疗不断发展，但由于高侵袭和高复发的特点，总体治疗效果较差。干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）、沉默信息调节因子3（SIRT3）与肝细胞癌的增殖和侵袭密切相关^[9-10]，基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）被认为是促使肿瘤细胞完成侵袭转移过程的关键性分子，其中最具有代表性的是MMP-2 和MMP-9，其与HCC的发生发展及预后密切相关^[11-12]。AKT信号通路在HCC发生发展过程中发挥重要作用，包括肝癌细胞凋亡、增殖、化疗耐药、侵袭转移过程等^[13-16]。AKT信号通路能够通过调节MMP-9的表达发挥调节HCC侵袭转移的作用^[17]。雌激素是否通过调节AKT信号通路活性抑制肝癌细胞侵袭转移尚不清楚。本研究拟观察雌激素是否通过调节AKT信号通路活性抑制肝癌细胞侵袭转移能力。

人肝细胞癌MHCC97H细胞株由本实验室保有。DMEM和胎牛血清购自Hyclone公司。AKT和p-AKT 购于cellsignal 公司，beta-actin 购自Santa-crus 公司。17-β-雌二醇（Estradiol）为Sigma公司产品。

MHCC97H肝癌细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，当细胞融合率达到70%~80%时进行传代，传代间隔约为2~3 d。17-β-雌二醇采用二甲基亚砜（DMSO）溶解，DMSO的最终浓度＜0.1%，其后用PBS稀释至工作浓度。待MHCC97H细胞长到融合后，PBS洗涤3次，加入无血清DMEM培养基培养24 h，之后按照实验要求加入雌激素，PBS（对照）。雌激素的浓度均为0、0.1和1 μmol/L，处理时间为24 h。其后提取总蛋白进行免疫印迹分析。

取对数生长期MHCC97H肝癌细胞，胰酶常规消化后利用血清浓度为2%的培养基制成5×10⁵细胞/mL 的细胞悬液，在Transwell小室上室中加入含有不同浓度雌激素的细胞悬液0.4 mL，下室中加入血清浓度为10%的常规培养基。24 h后取出小室对细胞进行固定，用棉签去除上室中残留细胞并对小室底部细胞进行固定、染色和拍照，并在显微镜下进行计数。

取对数生长期MHCC97H细胞，以合适的密度将细胞接种于6孔板，使用含2%血清的DMEM培养基，置于37 ℃孵箱中培养。待培养细胞生长至汇合80%时，用200 μL tip枪头在细胞表面制造“伤口”，加入不同浓度雌激素进行培养（0、0.1和1 μmol/L），分别在其后0和24 h后，用倒置显微镜观察，拍照记录伤口间距离。

雌激素处理MHCC97H细胞24 h，常规消化细胞后冰PBS洗涤2次，加入裂解液裂解细胞，离心提取蛋白。利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，并根据蛋白提取物浓度确定上样量。每次试验之前将蛋白煮沸变性、然后在SDS凝胶中每孔加入等量蛋白，根据目的蛋白分子量调整电泳时间和电压，电泳结束后转膜，将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭1 h。根据抗体说明书配置一抗浓度，然后将膜封闭于含有各种抗体的溶液中，4 ℃摇床过夜。次日PBST洗膜3次，然后常温封闭相应二抗1 h、再次用PBST 洗涤3 次，最后一次用PBS洗涤，洗涤时间均为15 min。最后利用成像系统对结果图像进行采集，并对数据进行分析。

所有数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析或t检验。取P＜0.05为差异具有统计学意义，本实验数据用SPSS17.0统计软件进行分析处理。

MHCC97H肝癌细胞具有较强的迁移能力，我们实验结果显示在划痕24 h后MHCC97H肝癌细胞的划痕能够愈合50%左右，但是在雌激素干预后，MHCC97H 肝癌细胞划痕的愈合速度明显减慢，随着浓度的升高，这种作用变得更加明显（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 雌激素干预对MHCC97H细胞划痕愈合的影响 Figure 1 Effect of estrogen on wound healing of MHCC97H cells (Original magnification: ×20) . A: Migration of MHCC97H cells after estrogen treatment; B: Compared with the control cells, estrogen-treated MHCC97H cells showed significantly decreased migration distance. *P＜0.05.

图 2(Figure 2)

图 2 雌激素对MHCC97H细胞侵袭转移能力的影响 Figure 2 Inhibitory effect of estrogen on invasion of MHCC97H cells. A: Cells penetrating the matrigel to arrive at the bottom of the chamber (× 400) ; B:Percentage of cells reaching the bottom of the chamber in different groups. *P＜0.05.

图 3(Figure 3)

图 3 雌激素对MHCC97H细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的影响 Figure 3 Inhibitory effect of estrogen on expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins in MHCC97H cells. A: Western blotting of MMP-2 and MMP-9in cells treated with estrogen; B: Relative expression level of MMP-2 and MMP-9. *P＜0.05 vs control.

图 4(Figure 4)

图 4 雌激素对AKT 信号通路活性的影响 Figure 4 Effect of estrogen on activity of AKT signal pathway. A: Western blotting of protein expressions of p-AKT in cells treated with estrogen; B: Relative expression of p-AKT. *P＜0.05 vs control.

MHCC97H肝癌细胞的侵袭能力较强，但在雌激素干预后，MHCC97H肝癌细胞的侵袭能力受到明显抑制，穿过基质胶到达小室底端的肝癌细胞数量明显减少，随着雌激素浓度的增加，穿过基质胶到达小室底端的MHCC97H肝癌细胞的数目逐渐减少，0.1 μmol/L和1 μmol/L浓度组MHCC97H肝癌细胞穿过基质胶到达小室底端的细胞数目，分别为对照组的（68.99±15.74）%和（34.28±8.17）%（P＜0.05）。

MMP-9表达的影响MMP-2和MMP-9在肝癌的侵袭转移过程中发挥重要作用。在雌激素干预后，MHCC97H肝癌细胞中，MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平明显降低，当浓度达到1 μmol/L时，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

性的影响AKT信号通路能够通过调节MMP-2和MMP-9等的表达与活性，调节肿瘤细胞的侵袭转移，而AKT的磷酸化水平能够反映AKT信号通路的活性。我们的结果显示，在雌激素作用后AKT的磷酸化水平明显降低，当浓度达到1 μmol/L 时，磷酸化水平降低为对照组的（90±2）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

肝细胞癌恶性程度较高且治疗选择有限，流行病学研究发现HCC在男性中的发病率远高于女性，且预后较差^{[1-2, 8, 18]}。男性患者中慢性肝病发展为肝硬化的进程也较为迅速，且肝硬化导致的肝癌多发生于男性和绝经后女性患者^[19]。进一步研究显示雌激素可抑制炎症诱导的HCC的发生，从而降低女性患者发生HCC风险，通过抑制NF-KB活性控制肿瘤生长^{[3, 6, 8]}。这些研究结果提示，雌激素在HCC的发生发展过程中发挥重要作用。

肝细胞癌的发生发展是多种因素共同作用的结果，累及到多个信号通路包括STAT3，NF-KB，Wnt/β-catenin，JNK等信号通路^{[3, 6, 8, 20-22]}。肿瘤细胞的侵袭转移过程也极为复杂，许多分子参与其中。在这个过程中肿瘤细胞需要从原发部位脱离，经过诸多环节最终到达转移位点。肿瘤细胞完成这一过程，需要获得特别的性能，这些新特性的获得能够帮助它们从原发肿瘤脱离、迁移进入周围组织、进入循环系统、到达远处并最终在到达部位形成新的肿瘤病灶。MMPs是促使肿瘤细胞完成侵袭转移过程的关键性分子，其中MMP-2 和MMP-9与HCC的发生发展及预后密切相关^[11-12]。AKT 信号通路在HCC发生发展过程中发挥重要作用，该通路可通过调节MMP-9的表达抑制肝癌细胞侵袭转移^[17]。研究还发现PTEN能够通过调节AKT信号通路进一步调节MMP-2和MMP-9的表达，抑制HCC的侵袭转移^[23]。此外，在乳腺癌相关的研究中显示，雌激素能够通过调节AKT信号通路的活性，发挥其在乳腺癌发生发展中的作用^[24-25]。雌激素对肝癌细胞侵袭转移的影响是否与AKT信号通路活性有关尚未见有文献报道。因此，我们假设雌激素有可能通过调节AKT信号通路活性抑制肝癌细胞侵袭转移。

已有文献报道17-β雌二醇能够抑制心肌细胞中MMP-9的表达^[26]，同时临床研究也显示肝癌组织中高表达MMP-9与肿瘤的侵袭转移有关，伴有门静脉癌栓形成HCC患者MMP-9的表达水平明显高于不伴有门静脉转移的HCC患者^[6]。我们的结果显示雌激素可抑制MHCC97H肝癌细胞的迁移和侵袭转移能力，且随着雌激素浓度的增加抑制作用增强，这些结果进一步支持雌激素对HCC发生发展的保护作用，与以前报道的文献一致^{[3, 6, 8]}。我们的结果还显示雌激素干预后，MHCC97H肝癌细胞MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平明显降低，伴随有AKT磷酸化水平的明显降低。这些结果证实了我们的假设，支持雌激素抑制肝癌的发生发展，至少部分通过调节AKT信号通路活性。

综上所述，我们的研究存在一些局限性，如选择单一的肝癌细胞株进行体外实验，仅有2个雌激素干预浓度，没有动物实验，没有肝癌患者的临床分期和预后的相关研究结果等。但是，我们的研究结果提示雌激素能够有效抑制MHCC97H肝癌细胞的侵袭转移，其可能部分通过调节AKT信号通路的活性进一步调节MMP-2和MMP-9的表达，这有待进一步的研究。