炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）及克罗恩病（Crohn's disease, CD），IBD的发病率呈逐年增高趋势，且有年轻化趋势^[1]。流行病学资料显示近10年上海地区0~14岁儿童IBD发病率从0.5/100万上升到6.1/100万，增长12倍^[2]。香港于2013年统计IBD发病率为3/10万，较2001年增加3倍^[3]。IBD按病情分期可分为缓解期及活动期，后者是病情恶化的过程，可出现消化道出血（gastrointestinal hemorrhage, GH）等症状，而GH 又可加重IBD患者贫血及感染等程度，因此GH具有极大的危害性^[4]。遗憾的是，目前尚缺少一种预测IBD患者并发GH的高敏感且特异的指标。此外，哪些因素可导致IBD患者进展为活动期，尚缺少相关研究。笔者在前期研究发现UC患者外周血CD8⁺CD28⁺ T细胞较正常组降低，而CD8⁺CD28^- T细胞升高，且两者所构成的平衡即CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值同样显著降低^[5]，因此笔者推测该平衡可能有助于预测IBD患者的活动期尤其是GH。本研究以此为目的，观察了49例IBD患者上述两个T细胞亚群及其平衡的变化，发现三者均与GH 显著相关，尤其以CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值预测GH 的敏感性及特异性最高，具有显著临床意义，过程如下。

根据中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制订的《2012年中华医学会炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》，选取2012年10月~2013年10月期间南方医科大学南方医院急诊科及消化内科的IBD患者作为观察对象，入选标准：（1）经肠镜及病理活检等方法确诊为UC或CD；（2）UC患者的病变范围符合蒙特利尔分类的E1-E3 类，病变严重程度符合Truelove 和Witts 分类的轻度及重度；（3）CD患者符合世界卫生组织推荐的CD 诊断标准（含非连续性或阶段性改变-肛周病变共6个项目），疾病严重程度在Harvey和Bradshow的简化CDAI 计算法的4~9分范围内；（4）患者具有良好的依从性，能够坚持随访。排除标准：合并以下情况之一者均予排除：其他类型慢性结肠炎（如放射性肠炎）、肿瘤、结核、慢性感染、自身免疫性疾病、妊娠^[6]。共入选49例，其中UC30例，CD19例；男性31例，女性18例；年龄13~69岁（39.31±14.75）岁。缓解期14 例，活动期35 例。以上UC及CD组的性别、分期构成以及年龄均无统计学差异（P=0.551、0.711及0.481，表 1）。

表 1(Table 1)

表 1 UC与CD患者的因素比较 Table 1 Comparison of the demographic and clinical data between UC and CD groups (χ2/t) Gender Classification UC (n=30) CD (n=19) Statistics P Age (year) Male Female 18 (36.7%) 12 (24.5%) 13 (26.5%) 6 (12.2%) 0.355 0.551 Stage - 40.3±13.7 37.2±16.4 0.711 0.481 Family history Remission Active 8 (16.3%) 22 (44.9%）) 6 (12.2%) 13 (26.5%) 0.138 0.711 5-ASA Yes No 13 (26.5%) 17 (34.7%) 9 (18.4%) 10 (20.4%) 0.077 0.782 Immunosuppressant Yes No 30 (61.2%) 0 (0%) 17 (34.7%) 2 (4.1%) -1.796 0.073 Steroids Yes No 19 (38.8%) 11 (22.4%) 19 (38.8%) 0 (0%) -2.966 0.003 Probiotics Yes No 15 (30.6%) 15 (30.6%) 15 (30.6%) 4 (8.2%) 4.106 0.043 Biological agent Yes No 11 (22.4%) 19 (38.8%) 12 (24.5%) 7 (14.3%) 3.278 0.070 Surgery Yes No 16 (32.7%) 14（28.6%) 18 (36.7%) 1 (2.0%) 9.388 0.002 Lasting time of remission Yes No 7 (14.3%) 23 (46.9%) 6 (12.2%) 13 (26.5%) 0.406 0.524 (week) - 30.0±13.9 24.5±10.3 1.482 0.145 Gastrointestinal hemorrhage Yes No 19 (38.8%) 11 (22.4%) 15 (30.6%) 4 (8.2%) 1.335 0.248

表 1 UC与CD患者的因素比较 Table 1 Comparison of the demographic and clinical data between UC and CD groups (χ2/t)

CD8-FITC及CD28^-PE抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。清晨空腹抽取患者肘静脉血约5mL，肝素抗凝。使用Hank's液等体积稀释，随后用Ficoll 进行密度梯度离心获取外周血单个核细胞，洗涤后将调整PBMCs 浓度为2×10⁹cells/L，随后加入CD8-FITC及CD28^-PE^[7]。使用Beckman生产的多色流式细胞仪检测，以CD8及CD28进行设门，每管获取细胞数1000个，运用Beckman Coulter Epics XL软件计算CD8⁺CD28⁺及CD8⁺CD28^- T细胞占所有淋巴细胞的百分比^[5]。

比较UC及CD组患者的家族史，5-氨基水杨酸类药物（5-ASA）、免疫抑制剂、激素、肠道微生态制剂（益生菌）及生物制剂（Biological agent, BA）的使用情况，以及随访期内手术率的差异^[8]。

对患者进行为期1年的随访，如果出现GH，则记录为阳性事件。比较UC及CD组患者缓解期维持时间（lasting time of remission, LTR）的差异^[9]；比较CD8⁺CD28⁺ T细胞、CD8⁺CD28^- T细胞及CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值在预测GH的效能差异；比较不同因素下UC 及CD患者的LTR差异。

定量资料采用均数±标准差差表示，计数资料采用n表示，采用两独立样本t检验比较两组间的差异，计数资料比较采用χ²或秩和检验；预测GH的敏感度及特异度的评价采用受试者工作特征（ROC）曲线法；不同因素下的LTR长短比较采用Kaplan-Meier法^[10]。相关性分析采用Spearmen法。使用统计软件包SPSS 17.0分析数据，当P＜0.05认为是差异有统计学意义。

UC与CD患者的家族史、5-ASA及益生菌服用情况、手术、LTR及GH共6个方面的差异均无统计学意义（P>0.05），而CD组的免疫抑制剂、激素及BA使用率均显著高于UC组（P=0.003、0.043及0.002，表 1）。

两组患者的CD8⁺CD28⁺及CD8⁺CD28^- T细胞均呈一定程度的表达，此两个T细胞亚群含量均在10%以上，以CD8⁺CD28^- T细胞略高于CD8⁺CD28⁺ T细胞（图 1A，B）。UC组患者的CD8⁺CD28⁺ T 细胞为（14.32±6.17）%显著高于CD 组的（9.40±4.38）%（t=3.022，P=0.004；图 2A），但CD8 +CD28^- T 细胞及CD8 +CD28 +/CD8⁺CD28^-比值无统计学差异（P=0.985 及0.094，图 2B，C）。

图 1(Figure 1)

图 1 UC及CD患者的CD8+ T 细胞流式细胞图 Figure 1 Flow cytometry for CD8+ T cells in UC and CD groups. The upper right quadrant represents the frequencies of CD8+CD28+ T cells, while the lower right one the CD8+CD28- T cells.

图 2(Figure 2)

图 2 UC与CD患者的CD8+ T细胞及其比值的柱状图 Figure 2 Bar charts for comparison of CD8+ T cells and their ratio between patients with UC and CD.

ROC结果显示CD8⁺CD28⁺ T细胞、CD8⁺CD28^- T 细胞及CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值三者在预测GH方面均具有良好的效能（均为P＜0.01，表 2），但曲线下面积（AUC）以CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-最大，达0.977，其次为CD8⁺CD28⁺细胞，为0.791（图 3）。截值分析显示当CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值取值为1.14时（13.95%/12.24%），其对应的敏感度达93.3%，特异度为91.2%。

表 2(Table 2)

表 2 CD8+ T细胞及其比值预测GH的AUC及可信区间 Table 2 Area under the curve and 95% confidence interval for CD8+ T cells and their ratio in predicting GH Test result variable (s) Area Std. Error (a) Asymptotic Sig.(b) Asymptotic 95% confidence interval Lower Bound Upper Bound CD8+CD28+ T cells 0.791 0.069 0.001 0.656 0.925 CD8+CD28- T cells 0.051 0.026 0.000 -0.009 0.093 CD8+CD28+/CD8+CD28- 0.977 0.017 0.000 0.943 1.010

表 2 CD8+ T细胞及其比值预测GH的AUC及可信区间 Table 2 Area under the curve and 95% confidence interval for CD8+ T cells and their ratio in predicting GH

图 3(Figure 3)

图 3 CD8+ T细胞及其比值预测GH的ROC曲线（对角线为诊断参考线） Figure 3 ROC curves of CD8+ T cells and their ratio in predicting GH (the diagonal was the diagnostic reference line).

表 3(Table 3)

表 3 BA与手术对LTR算数均数及中位数的影响 Table 3 Mean and median LTR of IBD patients who did or did not receive BA and surgical treatment Group Classification Mean Median χ2 P Estimate Std. Error 95% confidence interval Estimate Std. Error 95% confidence interval Lower Upper Lower Upper Bound Bound Bound Bound Yes 25.258 2.017 21.306 29.211 25.600 2.248 21.194 30.006 BA No 42.713 4.179 34.521 50.904 40.282 3.925 32.172. 47.993 9.730 0.002 Overall 31.752 2.425 26.999 36.504 30.900 3.240 24.550 37.250 Yes 18.668 2.664 13.447 23.889 17.400 3.974 9.612 25.188 Surgery No 36.280 2.755 30.880 41.680 32.800 2.113 28.659 36.941 15.981 0.000 Overall 31.752 2.425 26.999 36.504 30.900 3.240 24.550 37.250

表 3 BA与手术对LTR算数均数及中位数的影响 Table 3 Mean and median LTR of IBD patients who did or did not receive BA and surgical treatment

图 3(Figure 3)

图 3 CD8+ T细胞及其比值预测GH的ROC曲线（对角线为诊断参考线） Figure 3 ROC curves of CD8+ T cells and their ratio in predicting GH (the diagonal was the diagnostic reference line).

以上49例患者均无失访或删失。Kaplan-Meier分析显示未使用生物制剂（BA）及未行手术治疗的IBD患者算术及中位LTR均显著长于使用BA及已行手术的IBD患者（分别为χ²=9.730，P=0.002；χ²=15.981，P=0.000；表 3，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 BA与手术对缓解期持续时间（LTR）的生存曲线 Figure 4 Survival plots of BA and surgery on the lasting time of remission (LTR) in the IBD patients.

Spearman分析显示CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-与BA 及手术均成显著相关性（分别为P=0.009 及0.038），CD8⁺CD28⁺ T 细胞仅与BA 呈相关性（P=0.001），而CD8⁺CD28^- T细胞与BA及手术均无显著相关性（分别为P=0.307及0.058，表 4）。

表 4(Table 4)

表 4 CD8+ T细胞与BA及手术的相关性分析表 Table 4 Correlation analysis of CD8+ T cells with BA treatment and surgery Factor CD8+CD28+ T cells CD8+CD28- T cells CD8+CD28+/CD8+CD28- r P r P r P Biological agent 0.460 0.001 -0.149 0.307 0.368 0.009 Surgery 0.263 0.068 -0.273 0.058 0.297 0.038

表 4 CD8+ T细胞与BA及手术的相关性分析表 Table 4 Correlation analysis of CD8+ T cells with BA treatment and surgery

探索由缓解期进展为活动期的相关危险因素，具有显著的临床价值，因为活动期是IBD患者病情每况愈下、黏膜进行性破坏的直接原因。影响IBD患者病情转归的因素众多，可大体分为患者自身因素及外界干预因素两大类，后者以治疗因素为主^[11]。治疗因素又可分为药物及非药物因素，后者主要指手术及消化内镜治疗，近年兴起的经内镜粪菌移植治疗（FMT）^[12]也可以归入非药物治疗。按此思路，笔者入选了性别、年龄、家族史作为患者的自身因素，将5-ASA、免疫抑制剂、激素、益生菌及生物制剂作为药物干预因素，将肠道切除手术作为非药物干预因素。以IBD的类型即UC及CD作为分组依据，发现UC与CD患者的家族史、5-ASA及益生菌服用情况、手术、LTR及GH共6个方面的差异均无统计学意义，说明遗传因素在UC与CD的差异不明显，且两组患者的手术率及预后，即LTR及GH均无明显差别。在用药构成方面，UC与CD在是否使用5-ASA及微生态制剂同样无明显差别；而CD组的免疫抑制剂、激素及BA使用率均显著高于UC组，其原因如下：CD患者由于病灶分布广泛、多呈跳跃性，因此其药物强度及配伍率均较高^[13]，在这种情况下，免疫抑制剂及激素往往作为一线药物，在此类一线药物不敏感的情况，只能使用BA，故CD患者免疫抑制剂、激素及BA三者的使用率高于UC。

然而，临床上大量IBD患者坚持使用上述的免疫抑制剂、激素及BA，但此类患者为何仍由缓解期进展为活动期？这当中涉及到其他因素，尤其是免疫因素，后者是IBD发病的核心环节。结合笔者既往研究基础，本研究观察了CD8⁺ T免疫细胞及其比值在预测GH（活动期的直接临床表现）的价值。CD8⁺ T细胞属于杀伤性T细胞亚群，而CD28分子为共刺激分子：表达于CD8⁺ T细胞则成为CD8⁺CD28⁺ T细胞，具有杀伤、吞噬功能^[14]；而不表达CD28则成为CD8⁺CD28^- T细胞，具有免疫抑制及双向调节功能，属于调节性T细胞（Treg）亚群之一^[15]。组间比较结果显示UC组患者的CD8⁺CD28⁺ T细胞显著高于CD 组，而CD8⁺CD28^- T 细胞及CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值无统计学差异，但这并不能说明CD8⁺CD28⁺ T细胞预测GH的价值优于CD8⁺CD28^- T细胞及CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-平衡，而有待进一步的ROC分析证实；后者显示CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值对应的AUC最大，其次才为CD8⁺CD28⁺细胞。截值分析显示当CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值取值为1.14时（即CD8⁺CD28⁺ T 细胞取值13.95%，CD8⁺CD28^- T 细胞取值12.24%），其对应的敏感度及特异度均已超过90%，属于理想的诊断指标，这具有重要临床意义。以上印证了CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-比值的预测效能优势。

尽管UC与CD组患者的LTR无统计学差异（30.0±13.9 vs 24.5±10.3 周），但此类单纯的t检验并不能反映在不同的因素作用下的LTR是否存在差异。故笔者采用了Kaplan-Meier生存分析法比较不同因素对IBD患者LTR长短的影响，发现未使用BA及未行手术治疗的IBD患者算术及中位LTR均显著长于使用BA及已行手术的IBD患者，这与Papp等^[16]报道的一致。出现该现象的原因是：CD患者由于病灶分布广、侵袭性强，且由于症状不典型造成诊断延误^[17]，往往导致了病情恶化较UC明显，因此常需使用BA；此外，由于瘘管及穿孔率较UC高，CD患者往往需要接受手术治疗^[18]。

相关性分析显示CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-与BA及手术均成显著相关性，而CD8⁺CD28⁺ T细胞仅与BA呈相关性，但CD8⁺CD28^- T细胞与BA及手术均无显著相关性，这说明CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-与IBD的干预方式的相关度最高，而后者与病情转归直接相关。综合上述结果，笔者认为外周血CD8⁺CD28⁺ T 细胞降低或CD8⁺CD28^- T细胞升高均与IBD患者并发GH密切相关。CD8⁺CD28⁺/CD8⁺CD28^-平衡预测GH的效能理想，且当该比值低于1.14时，临床上需密切注意进展为活动期的可能，此时应嘱咐患者加强随访，这对于临床指导具有重要价值。本研究还存在不足，主要是例数较少，未进行长周期的观察随访，将在后续的研究中加以改进。