随着人口结构日趋老龄化，骨质疏松症的防治已成为全球关注的重大课题^[1]。虽然采用补充维生素D、增加钙摄入量以及雌激素替代疗法取得了不错的疗效，但却增加了患者罹患高钙血症以及乳腺癌的风险^[2-3]。电磁场作为一种物理刺激，因具有无创伤、无疼痛、使用便捷等优点引起了人们的广泛关注。研究表明电磁场可以提高实验动物的骨密度以及骨生物力学性能^[4]，减缓骨量丢失^[5]，增加骨质疏松症患者的骨矿盐沉积^[6]。但其作用机制仍不十分明确，有待进一步的研究。

G蛋白偶联的cAMP/PKA信号通路参与调节诸多细胞功能。细胞外信号分子与相应受体结合后激活与受体偶联的G蛋白，进而活化腺苷酸环化酶，引起第二信使cAMP浓度升高，cAMP再通过结合底物PKA的调节亚基而使其催化亚基释放，直接或间接地调节一系列细胞活动。研究表明cAMP/PKA/CREB信号通路参与人骨髓间充质干细胞的成骨性分化^[7]；调节MC3T3的成骨性分化^[8]，促进骨涎蛋白以及骨钙素的基因表达^[9]； 而特异性敲除实验动物G蛋白的α亚基，其骨小梁数量明显减少^[10]。那么电磁场是否通过G 蛋白偶联的cAMP/PKA信号通路促进骨形成，对此本文进行了研究，以深入探讨电磁场促进骨形成的分子机理。

本研究所用低频电磁场细胞处理仪由本课题组自行研制，发明专利号：ZL2011 10423102.0。整套装置由计算机控制模块、数模转化模块、信号放大模块、线圈、磁场传感器和温度传感器组成，可产生正弦波、三角波、方波、脉冲波、锯齿波等不同类型的均匀电磁场，频率5~200 Hz，强度0.0~9.0 mT 精确可调。可确保60 mm培养皿内所有细胞受到相同电磁场处理。实验过程中线圈置于细胞培养箱中，通过导线与外部装置连接（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 低频电磁场细胞处理仪 Figure 1 The device producing electromagnetic fields for cell exposure.

出生48 h以内的SPF级Wistar大鼠（甘肃省中医药大学动物实验中心，合格证号：SCXK( 甘)2004- 0006-152）；α-MEM培养基、Ⅱ型胶原酶（Gibco，美国）； 胎牛血清（兰州民海生物公司）；胰蛋白酶(西安科昊生物工程有限责任公司）；大鼠cAMP ELISA 试剂盒（R&D，美国）；p-PKA抗体、PKA抗体、RUNX-2 抗体、 OSX 抗体（abcam，美国）；β-Actin 抗体（bioworld，美国）；DDA、KT5720（Sigma，美国）；二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，AMRESCO，美国）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate,DEPC）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、5×蛋白上样缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL Plus超敏发光液（北京索莱宝科技有限公司）；RNAiso Plus Reagent、Prime Script^TM reagent Kit、 PCR扩增试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

如文献^[11]所述，取出生48 h 以内的Wistar 大鼠5只，置于75%的酒精中消毒后处死，取颅骨，剪成约2 mm²大小的骨碎片，PBS漂洗后置于培养瓶中，加入适量0.25%的胰蛋白酶，37 ℃水浴消化10 min，弃消化液，换用0.1%的Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化10 min，弃消化液，之后用0.1%的Ⅱ型胶原酶37 ℃水浴消化3次，每次20 min，收集消化液于盛有适量培养液的培养瓶中，200 目细胞筛过滤，1000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀使用培养液重悬，调整密度至3×10⁴细胞/mL，接种于90 mm培养皿中，置于37 ℃ 5% CO₂培养箱中培养，待细胞生长至90%以上融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代用于实验。

P1代ROBs以3×10⁴/mL的密度均匀接种于60 mm 培养皿中，待生长至接近融合时置于低频电磁场细胞处理仪中分别处理0、5、10、20、40 min、1、2 h，弃培养液，4 ℃预冷的PBS 清洗3 次，加入500 μL 0.1 mol/L HCl室温裂解细胞，收集细胞裂解液并吹打均匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，取上清，按照ELISA试剂盒说明书检测cAMP浓度。

P1代ROBs以3×10⁴/mL的密度均匀接种于60 mm 培养皿中，待生长至接近融合时采用不同条件处理： 50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场分别处理0、10、20、40 min、 1、2 h 后检测p-PKA及PKA的蛋白表达量；设立对照组、低频脉冲电磁场处理组、KT5720组、KT5720+低频脉冲电磁场处理组，分别予以不同条件处理，即对照组除加入与KT5720等量的DMSO^[12]外不做任何处理，低频脉冲电磁场处理组使用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，KT5720组使用10 μmol KT5720^[13]处理，KT5720+低频脉冲电磁场处理组在使用10 μmol KT5720 处理的同时采用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，连续处理3 d后检测OSX、RUNX-2、 β-actin 的蛋白表达量，之后弃培养液，4 ℃预冷的PBS 漂洗3 遍，加入PIRA 蛋白裂解液400 μL，充分裂解细胞，收集细胞裂解液，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，收集上清，取25 μL进行蛋白质浓度测定，剩余加入1/4体积的5×蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，待冷却后取20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗（p-PKA：1∶500，PKA：1∶1000；OSX：1∶800；RUNX-2：1∶600；β-Actin： 1∶1000）4 ℃孵育过夜，TBST清洗4 遍，每遍8 min，二抗（1∶10 000）室温振荡孵育2 h，TBST清洗4 遍，每遍8min，ECL Plus超敏发光液暗室发光显影，结果拍照后使用ipp软件进行扫描量化处理。

P1代ROBs以3×10⁴/mL的密度均匀接种于30 mm 培养皿中，分别设定对照组、低频脉冲电磁场处理组、 DDA组、DDA+低频脉冲电磁场处理组，待细胞生长至接近融合时分别予以不同条件处理，即对照组除加入与DDA等量的DMSO^[12]外不做任何处理，低频脉冲电磁场处理组使用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5h，DDA组使用10 μmol DDA^[13-14]处理，DDA+低频脉冲电磁场处理组在使用10 μmol DDA处理的同时采用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，连续处理3、6、9d后测定其ALP活性，检测方法如试剂盒说明书所述，即弃培养基，PBS漂洗3次，加入基质液和缓冲液各250 μL，轻微震荡混匀，37 ℃孵育15 min，加入显色液750 μL，轻微震荡混匀，520 nm处测定吸光值，根据公式换算得到ALP活性值。

P1 代ROBs以3×10⁴细胞/mL 的密度均匀接种于60 mm培养皿中，分别设定对照组、低频脉冲电磁场处理组、DDA组、DDA+低频脉冲电磁场处理组、KT5720 组、KT5720+低频脉冲电磁场处理组，待细胞生长至完全融合时分别予以不同条件处理，即对照组除加入与DDA/KT5720等量的DMSO外不做任何处理，低频脉冲电磁场处理组使用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，DDA组使用10 μmol DDA处理，DDA+ 低频脉冲电磁场处理组在使用10 μmol DDA处理的同时采用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，KT5720 组使用10 μmol KT5720 处理，KT5720+低频脉冲电磁场处理组在使用10 μmol KT5720处理的同时采用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场每天处理1.5 h，连续处理3 d后弃培养液，4 ℃预冷的PBS漂洗3次，加入1mL RNAiso Plus Reagent于冰上裂解细胞，收集细胞裂解液，加入200 μL氯仿，振荡混匀后4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min，吸取上清，加入等体积异丙醇，轻微上下颠倒混匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心20 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇（DEPC水现配现用）清洗沉淀，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入适量DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度计于230、260、280、320 nm处检测RNA 质量，根据RNA 浓度使用Prime Script^TM reagent Kit进行反转录：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反转录产物cDNA使用PCR扩增试剂盒进行扩增：95 ℃ 30 s变性，95 ℃ 5 s退火，60 ℃ 31 s延伸，40个循环。引物序列如表 1所示。数据使用2^-△△CT法进行分析。

表 1(Table 1)

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences Gene GeneBank No. Primer sequences Gapdh NM_017008.3 Forward 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3' Reverse 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3' Bmp-2 NM—017178 Forward 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3' Reverse 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3' Osx NM_001037632.1 Forward 5'-GCCTACTTACCCGTCTGACTTT-3' Reverse 5'-GCCCACTATTGCCAACTGC-3' Collagen-1 NM—053356 Forward 5'-TTCCCG GTGAATTCGGTCTC-3' Reverse 5'-ACCTCGGATTCCAATAGGACCAG-3'

表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences

所有数据使用SPSS 20.0统计软件进行分析，其中组间差异采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD 方法统计分析。结果以平均数±标准差表示，当P<0.05 时表示差异有统计学意义，当P<0.01时表示差异有显著统计学意义。

低频脉冲电磁场处理后ROBs内cAMP浓度变化如图 2所示，在电磁场连续处理5、10 min时cAMP浓度未发生明显变化，至处理20 min后出现升高，较对照组有显著的统计学意义（P<0.01），持续至40 min后开始下降，至1 h时较对照组无统计学差异，2 h时再次升高，较对照组有统计学意义（P<0.05），说明低频脉冲电磁场引起第二信使cAMP浓度的升高。

图 2(Figure 2)

图 2 低频脉冲电磁场处理后ROBs内cAMP浓度变化 Figure 2 Changes of cAMP concentrations after PEMF treatment. *P<0.05,**P<0.01.

为检测cAMP浓度升高是否引起PKA磷酸化水平的变化，实验检测了低频脉冲电磁场处理后不同时间p-PKA的浓度变化，结果如图 3所示，经电磁场处理后，p-PKA浓度出现短暂降低，之后升高，在20、40 min时较对照组有显著的统计学意义（^**P<0.01），之后回归至对照组水平，于2 h时再次升高（^**P<0.01），说明第二信使cAMP浓度的升高引起了PKA磷酸化水平的变化。

图 3(Figure 3)

图 3 低频脉冲电磁场处理后ROBs内p-PKA浓度变化 Figure 3 Changes of the levels of p-PKA after PEMF treatment. **P<0.01.

为明确电磁场所引起的成骨性分化过程与第二信使cAMP之间的关系，ROBs经相应分组处理后测定其ALP活性，结果如图 4所示，不论处理3、6 d还是9 d，低频脉冲电磁场处理组ALP活性均显著升高，其差异较对照组有统计学意义（^**P<0.01，^*P<0.05），单纯DDA 处理未对ROBs 的ALP 活性产生明显影响，而使用DDA抑制AC活性后，低频脉冲电磁场促ALP活性升高的能力减弱，其差异较单纯低频脉冲电磁场处理组有统计学意义（^##P<0.01，^#P<0.05），说明低频脉冲电磁场促进ALP活性升高与cAMP浓度变化紧密联系。

图 4(Figure 4)

图 4 抑制剂DDA对低频脉冲电磁场处理后ALP活性变化的影响 Figure 4 Effect of DDA on the ALP activities after PEMF treatment. C: Control group; P: PEMP group; D: DDA group; D+P: DDA+PEMP group. *P<0.05,**P<0.01 vs C group,#P<0.05,##P<0.01.

ROBs经分组处理后收集基因检测成骨相关因子的基因转录水平，结果如图 5所示，低频脉冲电磁场处理组Osx、Col-I、Bmp-2的表达量均较对照组显著升高（^**P<0.01，^*P<0.05），单纯DDA处理未对ROBs的成骨性基因转录产生明显影响，而使用DDA抑制AC活性后，低频脉冲电磁场促Osx、Col-I、Bmp-2基因转录的能力明显削弱，说明低频脉冲电磁场介导的成骨性基因转录增强与cAMP浓度升高相关。

为检测电磁场骨形成效应与PKA磷酸化之间的关系，实验使用PKA 特异性抑制剂KT5720 预处理ROBs，观察其对电磁场提高成骨性基因转录的影响，结果如图 6所示，低频脉冲电磁场显著提高了成骨性基因Osx、Col-I、Bmp-2的表达（^**P<0.01，^*P<0.05），抑制剂KT5720未对ROBs成骨性基因的转录产生明显影响，而当其抑制PKA的活性后，由低频脉冲电磁场引起的成骨性基因转录增强的现象消失（^##P<0.01），说明cAMP下游底物PKA参与了低频脉冲电磁场促进成骨性基因转录的过程。

上文显示抑制剂KT5720削弱了电磁场引起的成骨性基因转录的变化，那么其是否也影响了成骨性蛋白的表达呢？为此实验采用Western blotting 检测了KT5720预处理后低频脉冲电磁场对成骨性蛋白表达的影响，结果如图 7所示，低频脉冲电磁场处理后成骨性蛋白的表达升高（^**P<0.01），单纯使用KT5720 未对ROBs成骨性蛋白的表达产生明显影响，而KT5720却抑制了低频脉冲电磁场所引起的成骨性蛋白表达的增强（^##P<0.01），说明PKA也参与了低频脉冲电磁场引起的成骨性蛋白的表达。

图 5(Figure 5)

图 5 抑制剂DDA对低频脉冲电磁场处理后成骨性基因转录变化的影响 Figure 5 Effect of DDAon the osteogenic gene transcription after PEMF treatment. *P<0.05,**P<0.01.

图 6(Figure 6)

图 6 抑制剂KT5720对低频脉冲电磁场处理后成骨性基因转录变化的影响 Figure 6 Effect of KT5720 on the osteogenic gene transcription after PEMF treatment. *P<0.05,**P<0.01 vs C group,##P<0.01.

图 7(Figure 7)

图 7 抑制剂KT5720对低频脉冲电磁场处理后成骨性蛋白表达变化的影响 Figure 7 Effect of KT5720 on the osteogenic protein expression after PEMF treatment. *P<0.05,**P<0.01 vs C Group,##P<0.01.

低频脉冲电磁场在临床上用于骨折愈合已有近半个世纪的历史^[15]，许多研究表明低频脉冲电磁场可以促进骨形成^[16-17]。本课题组经研究发现50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场可以显著促进ROBs矿化成熟^[18]，然而其具体的作用机制仍不十分清楚，有待研究。cAMP作为第二信使，广泛参与调节细胞功能，自发现以来就引起人们的广泛关注。研究表明小分子的cAMP类似物可以特异性地激活PKA，进而促进MC3T3-E1的矿化成熟^[19]，cAMP/PKA 信号通路参与淫羊藿苷促进骨形成的过程^[20]。本文通过一系列研究发现，cAMP/PKA信号通路参与50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场促进骨形成的过程。

cAMP作为第二信使，在细胞内的浓度受到严格的控制，以完成对细胞功能的精确调控。本文通过检测经低频脉冲电磁场不同时间处理后细胞内cAMP 及p-PKA浓度的变化发现，在电磁场处理20 min后ROBs 内cAMP浓度显著升高，持续至40 min后降低，至2 h时再次升高，PKA的磷酸化也表现出相同的变化趋势，在电磁场处理20、40 min时较对照组有显著的统计学意义，之后降低，2 h时再次升高，说明低频脉冲电磁场激活了cAMP/PKA信号通路。而使用DDA抑制cAMP 的合成后发现，成骨性分化早期指标ALP活性显著下降，成骨相关基因Osx、Col-I和Bmp-2的转录亦显著下降，说明低频脉冲电磁场通过第二信使cAMP 调节ROBs的成骨性分化。同样，使用KT5720抑制PKA的磷酸化之后，由电磁场所引起的成骨性基因转录及蛋白表达的增强亦减弱，说明cAMP下游底物PKA也参与了低频脉冲电磁场促进骨形成的过程。

作为普遍存在于生物有机体中的重要信号转导方式，cAMP/PKA信号通路通过多种方式调节细胞功能，在骨代谢调节过程中发挥着重要作用，本文通过研究发现50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场通过激活cAMP/PKA 信号通路促进骨形成，然而亦有研究显示cAMP/PKA 信号通路在骨髓间充质干细胞的分化过程中扮演相反的角色，促进其成脂性分化而抑制其成骨性分化^[21-22]，参与破骨细胞的分化^[23]，那么，在细胞复杂而高度可控的代谢调节网络中，低频脉冲电磁场通过cAMP/PKA信号通路促进骨形成的过程又受到了哪些调节，与其他信号通路之间存在何种关联，仍有待进一步的研究。