类风湿关节炎（RA）是一种病因不明、以关节炎症损伤为主的慢性自身免疫性疾病，在我国RA的发病率为0.32%~0.36% ^[1]。其主要病变发生在滑膜，累及关节软骨、韧带、肌腱及全身组织，引起关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期关节畸形、功能活动障碍，最终导致不同程度的残疾。

补体系统是重要的先天性固有免疫，是机体免受病原体侵害的第一道防御系统。甘露糖凝集素（MBL）是补体凝集素途径的主要蛋白质，它作为模式识别受体，通过识别病原微生物和细胞的碎片，最终激活补体系统的级联反应，补体激活产生的炎症介质参与RA的损伤过程^[2]。MBL相关的丝氨酸蛋白酶-2（MASP-2）是由肝脏合成分泌的，与MBL相关的MASP有四类（MASP-1，MASP-2，MASP-3和sMAP），其中MASP-2是凝集素途径中关键蛋白酶。MBL途径激活补体过程中，MASP-2直接被激活，不需要抗原抗体的参与，被激活MASP-2能够有效的裂解C₄和C₂产生C₃裂解酶^[3-4]从而激活补体级联酶促反应^[5]。MASP2基因位于1p36.3-36.2染色体，最近的研究发现RA和其它炎性自身免疫性疾病与该区域有相关性^[6-7]。急性期蛋白HsCRP在体内外均能激活补体系统，血清中HsCRP的水平与RA的活动程度密切相关^[8]，HsCRP的水平已作为辅助诊断RA的重要参数之一。有关RA的研究目前多表现在基因多态性及基因突变方面，对于同时检测血清中MBL、MASP-2水平国内尚未见报道。本文通过检测RA患者血清中的MBL、MASP-2、HsCRP和C₃的水平，研究它们在RA疾病中的意义，为揭示RA的发生机制及其诊治提供实验依据。

RA患者50例（活动期25例和非活动期25例），为2015年2月~2015年11月来我院就诊的住院病人，其中男5例，女45例，年龄23~81岁，平均年龄50.54±14.26岁，均符合欧洲风湿病联盟和美国风湿病学会类风湿关节炎的诊断标准（2010年），并排除其他自身免疫性病、感染等疾病。健康人群40名，男18例，女22例，年龄25~66岁，平均年龄46.60±11.89岁，排除标准：（1）有严重心、肝、肾等重要脏器和血液、内分泌系统病史者；（2）孕妇、哺乳期妇女；（3）无急慢性感染性疾病；（4）恶性肿瘤患者；（5）无糖皮质激素及免疫调节药应用史；（6）无免疫疾病史和严重感染史。

MBL、MASP-2定量分析试剂盒（ELISA）购自加拿大ELIXIR医药公司；HsCRP检测试剂盒（免疫比浊法）购自德国罗氏诊断有限公司；MBL/MASP-2检测用德国Berthold公司Multimode Microplate Reader仪。

采集检测者晨起空腹静脉血4.0 mL，分离血清，保存于-80 ℃待测。MBL和MASP-2含量的检测均采用竞争性抑制酶联免疫吸附法。所有血清标本溶解并恢复至室温，3500 r/min离心10 min，取上清液10 μL，用生理盐水加以稀释。具体操作步骤严格按试剂盒说明进行操作，酶标仪450/630 nm双波长测吸光度（A）值，根据标准浓度及测得OD值，换算出血清MBL和MASP-2的浓度。

两者均采用免疫比浊法，人血清HsCRP和补体C₃可与比浊法试剂中特异性抗血清形成沉淀物，用COBAS8000全自动生化分析仪对血清直接进行稀释检测，自动计算出每份样本的分析物浓度。

应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用t检验，检验水准设在P=0.05，以P < 0.05为差异有统计学意义。以Pearson积距相关分析MBL与MASP-2、HsCRP、C₃变量之间的相关性。

所有群体均来自于兰州大学第二医院住院患者和健康体检者，常规检查（表 1）包括：血压，血糖，血脂，血沉（ESR）和抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP）。

表 1(Table 1)

表 1 RA患者和健康人群的一般资料特征 Table 1 General demographic and clinical data of the patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthysubjects Index RA group (n=50) Healthy control group (n=40) P Age (year) 50.54±14.26 46.60±11.89 - Male/Female (5/45) (18/22) - SBP (mmHg) 119.51±10.76 116.40±9.58 0.29 DBP (mmHg) 78.80±11.63 76.86±13.06 0.57 GLU (mg/dL) 4.77±0.83 4.86±0.73 0.69 CHO (mg/dL) 3.90±0.96 4.16±0.87 0.32 HDL (mg/dL) 1.22±0.50 1.25±0.53 0.84 LDL (mg/dL) 1.04±0.29 1.02±0.36 0.82 TG (mg/dL) 1.30±0.37 1.31±0.36 0.91 ESR (mm/h) 50.44±34.28 9.08±7.74 =0.001* Anti-CCP (RU/mL) 105.53±93.21 12.56±4.52 =0.001* Note: SBP: Systolic Blood Pressure; DBP: Diastolic Blood Pressure; GLU: Glucose; CHO: Total cholesterol; HDL: High-density lipoprotein; LDL: Low density lipoprotein; TG: Triglyceride; ESR: Erythrocyte sedimentation tate; anti-CCP: Anti-cyclic citrullinated peptide antibody. **P < 0.01 vs healthy control group.

表 1 RA患者和健康人群的一般资料特征 Table 1 General demographic and clinical data of the patients with rheumatoid arthritis (RA) and healthysubjects

检测MBL、MASP-2、HsCRP和C₃ 4组数据均符合正态分布，组间比较采用t检验，P < 0.05有统计学意义。与健康对照组相比较，MBL、MASP-2、HsCRP指标均有显著性差异。尤其以活动期较为显著（P < 0.001）；C₃组间无差异（表 2，图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 RA组与健康对照组血清MBL、MASP-2、HsCRP和C3水平比较 Figure 1 Comparison of serum MBL (A), MASP-2 (B), HsCRP (C), and C3 (D) levels in RA patients and healthy control group.

表 2(Table 2)

表 2 RA患者和健康对照组血清MBL、MASP-2、HsCRP和C3水平比较 Table 2 Serum levels of MBL, MASP-2, HsCRP, and C3 in RA patients and healthy subjects (Mean±SD) Group n MBL (ng/mL) MASP-2 (ng/mL) HsCRP (mg/L) C3(g/L) Active RA 25 10.05±2.14** 75.90±9.21** 40.53±34.81** 1.00±0.16 Inactive RA 25 14.79±3.93* 107.8±14.90** 2.97土2.51* 1.00±0.14 Healthy group 40 26.97±11.78 251.78±34.5 1.42±1.70 0.99±0.14 *P < 0.05, **P < 0.01 vs healthy control group.

表 2 RA患者和健康对照组血清MBL、MASP-2、HsCRP和C3水平比较 Table 2 Serum levels of MBL, MASP-2, HsCRP, and C3 in RA patients and healthy subjects (Mean±SD)

RA组MBL与MASP-2、HsCRP、C₃相关性分析（图 2），经双变量Pearson相关性分析得出RA组MBL与MASP-2含量呈显著正相关（r=0.550、P=0.001）；与HsCRP含量呈低度负性相关（r=-0.323，P=0.022）；与C₃含量无相关（r=0.022，P=0.882）。RA组MASP-2与HsCRP含量呈低度负性相关（r=-0.453，P=0.001）；与C₃含量无相关（r=0.049，P=0.738）。

图 2(Figure 2)

图 2 RA组血清MBL与MASP-2、HsCRP、C3含量的相关性分析 Figure 2 Correlation among serum levels of MBL, MASP-2, HsCRP, and C3 in RA patients. A: Correlation between MBL and MASP-2; B: Correlation between MBL and HsCRP; C: Correlation between MBL and C3; D: Correlation between MASP-2 and HsCRP; E: Correlation between MASP-2 and C3.

图 3(Figure 3)

图 3 RA组血清MBL、MASP-2、HsCRP和C3的ROC曲线 Figure 3 ROC curve of serum MBL, MASP-2, HsCRP and C3 in RA group.

分别以MBL、MASP-2、HsCRP和C₃为检验变量，进行ROC曲线分析，以1-特异度为横轴，灵敏度为纵轴，SPSS软件绘制ROC曲线并计算最佳界值。MBL、MASP-2、HsCRP和C₃曲线下面积分别为0.266、0.025、0.844、0.663，其拥有诊断RA的显著性分别为P=0.001、P=0.001、P=0.001、P=0.009。公式：尤登指数=敏感性+特异性-1，求得MBL、MASP-2、HsCRP和C₃的尤登指数分别为-0.8，-0.275，0.54，0.26，最佳界值（cutoff值）分别是12.96、121.74、1.57、1.05 mg/L。虽然4个指标均有统计学意义，但血清HsCRP的ROC曲线下面积大于0.5，对RA的诊断更具有意义，而血清MBL和MASP-2的ROC曲线下面均小于0.5，不能作为辅助RA诊断及其活动度评价的的独立因素。

MBL是由肝脏合成的C型凝集素样急性时相期蛋白，它通过结合病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖等糖基配体而直接介导调理吞噬作用，或通过凝集素途径激活补体系统，从而在机体的天然免疫防御中发挥重要作用^{[9, 18]}。本研究选取的实验对象包括RA活动期、非活动期和健康对照人群的年龄大致相似，健康人群性别比按男女约1:1匹配。RA活动期及非活动期判断依据为中华医学会编著临床诊疗指南（风湿病分册）^[10]，主要指征有晨僵、关节压痛、肿胀，炎性指标有ESR、CRP等。血清MBL缺乏，增加了细菌、病毒感染和RA的风险，它与免疫调节和炎症复发的敏感性有关。Yang等^[11]研究发现RA患者血清及滑膜液中补体C₃、C₄及免疫复合物增加，表明补体系统参与RA发生过程。近年来研究表明^{[8, 12]}，补体系统和HsCRP在RA发病机制中起重要作用，检测血清中的补体和HsCRP对RA的疗效及预后的判断有一定的临床意义。Ip WK等研究表明^[13]：香港南部地区人群中MBL基因表型和等位基因的变异中发现，低水平的MBL可诱发RA的发展，是导致该疾病严重的独立的危险因素之一。研究显示^[13-14]，RA患者血清MBL水平与健康对照组比较显著性降低，差异有显著性，血清MBL缺乏可能是发生RA危险因素之一。有研究表明巴西人群MBL2多态性与MBL血清水平与RA的易感性具有显著相关性, 对RA患者进行治疗时必需考虑MBL水平^[15]。侯玲等^[16]研究了宁夏回族MBL基因突变与RA相关性，MBL52C/T位的等位基因可能参与RA的发生。我们研究的目的是通过检测兰州地区RA患者血清中MBL、MASP-2水平，来推测MBL途径是否参与了RA病情的发展。结果表明MBL含量显著降低（P=0.001），可能与RA患者体内MBL参与凝集素途径的激活，导致其大量消耗使血清水平降低，表明MBL参与RA发生发展的损伤过程。Goeldner等^[17]研究中发现血清MASP-2水平活性下降是受基因突变的影响，MASP-2基因单倍体2A1和2B1-i发生变异者，RA易感性明显增加。MASP-2的基因突变（GAC120GGC）导致编码产物由Asp变为Gly，该突变使得MBL及纤维蛋白胶凝素与MASP-2蛋白的结合能力下降，阻碍了MBL途径的激活^[18]，引起病原体的反复感染。我们的研究显示，与健康对照组比较MASP-2水平在RA活动期和非活动期均显著性下降（P < 0.01），以活动期下降更为显著。表明MASP-2水平的下降可能与RA患者病情进展相关，MASP-2水平的下降并非合成降低，而是消耗增加。

在一般资料中，RA患者和健康人群中血沉（ESR）和抗环瓜氨酸肽抗体（Anti-CCP）均升高，与健康组比较有显著性差异（P=0.001），表明在炎症状态下血浆中的球蛋白和纤维蛋白原的变化，使得血沉加速。Anti-CCP是RA早期诊断指标，Kim等^[19]研究发现Anti-CCP阳性患者出现严重的关节损坏明显多于阴性患者，表明抗CCP抗体与疾病的活动度相关。HsCRP是组织损伤时血浆中急剧上升的急性蛋白，在机体的天然免疫过程中发挥着重要的保护作用，是组织损伤和感染后监测炎症和感染的常规参数。我们的结果显示：RA患者血清中C₃水平升高，但无统计学差异（P> 0.05）。表明在严重RA患者中，补体合成减少与消耗增加，RA患者可表现补体水平的减低。

RA患者对关节的损伤程度越重，MBL与MASP-2水平和活性越低，表明MBL、MASP-2参与MBL途径活化补体。MBL途径在RA的早期诊断中具有参考意义，MBL、MASP-2水平的检测不能作为疾病活动程度的评价指标，可作为预测疾病病情发展的依据之一。HsCRP是炎症和组织损伤的灵敏性指标，在RA活动期急剧增高。ESR、Anti-CCP是RA早期诊断及预后的重要指标。相关性分析表明RA患者血清MBL水平与MASP-2呈显著正相关；检测血清中MBL、MASP-2水平对RA的早期诊断有一定的参考意义。经ROC曲线分析，血清HsCRP的ROC曲线下面积最大，对RA的诊断更具有意义，而血清MBL、MASP-2水平ROC曲线下面积较小，对RA的诊断仅有一定的参考意义。