严重烧、创伤及外科大手术应激打击极易诱发脓毒症等感染并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），是临床烧、创伤和危重患者最主要死亡原因之一。尽管临床治疗已取得显著进展，但病死率仍居高不下，成为直接影响患者预后、阻碍进一步提升危重烧伤救治成功率的突出难题，因此，提高对脓毒症的认识和防治水平无疑具有重要的理论价值及临床意^[1]。

淋巴细胞凋亡在维持免疫稳态和自身免疫耐受中起着重要作用。在严重创伤打击时，无论是在中枢还是外周淋巴器官中均发现了大量淋巴细胞凋亡^[2]。淋巴细胞凋亡增加可能是机体免疫抑制发生的重要机制之一^[3-4]。Smad2和Smad3是转化生长因子β1（TGFβ1）下游受体激活蛋白，活化的TGFβ1使Smad2/Smad3发生磷酸化而被激活，受到Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白的调节，通过细胞色素C的释放激活胱天蛋白酶（caspase-9）。最终活化的caspase-8、caspase-9都通过激活下游的caspase-3介导细胞的调亡。Bcl-2、Bcl-xl维护线粒体的完整性从而阻碍了细胞色素C的释放；Bax、Bim等促凋亡成员则促进了这一过程的发生。

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白-8样分子2（TIPE2）是新近发现的蛋白，在体内试验中，敲除小鼠TIPE2基因两个月后发现部分动物出现慢性疾病，表现为体重减轻、脾肿大、白细胞增加和多器官自发性炎症反应，说明TIPE2缺乏容易诱发广泛性炎症^[5-6]。本课题组先前研究已证实TIPE2在烫伤小鼠T淋巴细胞存在表达，烫伤后24 h表达最高^[7-8]，并且发现沉默TIPE2后烫伤小鼠中IFN-γ显著升高而IL-4水平显著下降，IFN-γ/IL-4比值明显升高，说明脾脏TIPE2可能参与组织局部促炎和抗炎性细胞因子表达调节，并对局部免疫产生影响。我们假设TIPE2是介导严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能障碍的关键调控分子，并很可能通过线粒体相关凋亡途径调节T淋巴细胞凋亡发挥作用。本研究通过研究TIPE2与CD4⁺ T细胞凋亡之间的关系，探讨其参与严重烧伤后脓毒症的调控机制。

实验小鼠为健康清洁级BALB/C小鼠，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，均为雄性，体质量20±2 g。140只成年雄性BALB/C小鼠分为6组：烫伤组（burn）40只，假伤组（Sham）40只，沉默TIPE2组（siTIPE2-burn）15只，沉默病毒对照组（siTIPE2-siTIPE2-negative-burn）15只，过表达TIPE2组（TIPE2-burn）15只，过表达病毒对照组（TIPE2-negative -burn）15只。

TIPE2小RNA干扰慢病毒表达载体（siRNA）由上海吉凯公司合成，siRNATIPE2的DNA靶序列为5'-GAAGTGAAACTCAGGTCCG-3'^[5]，对照组RNA序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。过表达DNA靶序列上游引物为GAGGATCCCCGGGTACCGGTC GCCACCATGGAGTCCTTCAGCTCA，下游引物为TCCTTGTAGTCCATACCGAGCTTGCCCTCGTCC AG。过表达对照组采用空载体质粒。合成DNA片段转移至pGCL-GFP构建pFIV-H1/U6-copGFP载体，转染过程严格按照说明书执行。

小鼠适应性饲养1周，自由进食水，室温25 ℃，昼夜节律为12 h。术前禁食12 h，自由饮水。小鼠乙醚麻醉后，剃去背部鼠毛，暴露背部在99 ℃热水中烫8 s，根据公式计算小鼠体表面积，造成15%面积皮肤烫伤模型。假伤组小鼠除了浸泡温水，其他麻醉方式和喂养同烫伤组。后4组通过尾静脉分别注射携带siTIPE2/过表达或空载体对照慢过表达或空载体对照慢病毒，待2周后复制小鼠burn模型，术后予0.9%生理盐水40 mL/kg抗休克治疗，所有小鼠在烫伤24 h处死。动物实验相关方案通过动物伦理委员会批准，动物处置过程所有操作符合动物伦理学标准。

小鼠断颈处死后无菌条件下取脾脏，分离小鼠脾脏单个核细胞。采用MiniMACS免疫磁性分离系统，每108个单核细胞加入100 μL生物素-抗体“鸡尾酒”，4 ℃避光预冷10 min。然后加入300 μL PBS，200 μL抗生物素磁珠4 ℃避光预冷15 min后离心洗涤。500 μL PBS重悬细胞，通过LS柱阴性分选后收集留出的细胞悬液，离心洗涤获得CD4⁺ T细胞，分离出的CD4⁺ T用FITC标记抗CD4抗体孵育，流式细胞术鉴定正常小鼠脾脏CD4⁺ T细胞纯度（图 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 Western blot检测burn组、TIPE2-burn组和siTIPE2-burn组TIPE2蛋白表达 Figure 1 Expressions of TIPE2 in burn, TIPE2-burn and siTIPE2-burn groups

根据PE Annexin-V凋亡试剂盒，离心收集细胞（5×10⁵），用预冷的PBS洗2遍（1200 r/min离心8 min）；加入100 μL的稀释液1% Binding buffer重悬细胞，分别加入5 μL Annexin V和7AAD混匀，4 ℃避光反应20 min；加入300 μL的稀释液Binding buffer，1 h内流式细胞仪检测。

检测各组小鼠CD4⁺ T淋巴细胞内TIPE2，Smad2/ Smad3、磷酸化（P）-Smad2/P-Smad3以及Bcl-2/Bim的蛋白表达。采用BCA法对小鼠CD4⁺ T细胞总蛋白进行定量分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中细胞蛋白上样量均为50 μg，取30 μL浓缩物上样，用100 g/L聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。第一抗体为兔抗鼠TIPE2多克隆抗体（1:500），兔抗鼠Smad2单克隆抗体（1: 2000），兔抗鼠（P）-Smad2多克隆抗体（1:500），兔抗鼠Smad3单克隆抗体（1:2000），兔抗鼠（P）-Smad3单克隆抗体（1:2000），兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体（1:1000），兔抗鼠Bim多克隆抗体（1:500），第二抗体为辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG（1:2500），单克隆β-actin作为蛋白对照，比较烫伤组和烫伤RNAi-TIPE2组TIPE2蛋白表达情况，观察TIPE2基因沉默效果。应用ImageJ软件分析目标条带的灰度值进行蛋白定量。

按JC-1试剂盒说明书配制染色工作液。将各组细胞重悬于0.5 mL细胞培养液中，并加入0.5 mL的JC-1染色工作液，颠倒数次以混匀。于细胞培养箱中37 ℃孵育20 min，600 r/min 4 ℃离心3~4 min，沉淀细胞。弃上清，用JCM染色缓冲液洗涤2次后行流式细胞仪分析。

收集5×10⁵各组小鼠CD4⁺ T细胞，PBS润洗3次，1500 r/min离心5 min，弃上清，收集细胞。加入4%多聚甲醛溶液500 μL室温下固定30 min，PBS洗涤去上清，加入500 μL 0.2%的TritonX-100室温下穿孔20 min。PBS润洗细胞2次，1200 r/min离心5 min，弃上清。加入500 μL阻断缓冲液（1% BSA），室温下封闭30 min。按1:400比例用1% BSA稀释细胞色素C抗体500 μL，4 ℃反应过夜。PBS洗涤1遍，1:200比例稀二抗500 μL避光孵育1 h，PBS润洗细胞2次，弃上清。加入200 μL的DAPI染色30 min。载玻片滴20 μL样本，加1滴DAPI混匀，加盖玻片，激光扫描共聚焦显微镜观察。

取收集1×10⁶各组小鼠CD4⁺ T细胞，PBS洗涤2次，弃上清，加入250 μL预冷的Lysis buffer混匀，冰浴10 min将样品细胞裂解，1000 g离心5 min，收上清转移至EP管中。检测取96孔培养板中进行，反应体系包括：100 μg蛋白（体积50 μL）、50 μL现配的反应液、5 μL的caspase比色底物，37 ℃避光孵育2 h，Spectra MR全功能酶标仪上检测405 nm处的吸光度值。实验设调零孔组2个，一组为不加蛋白样本组，另一组为不加比色底物组，剩余体积均由稀释液补足。各实验组设2个空白孔。

采用SPSS17.0统计软件，数据采用均数±标准差表示，组间样本比较采用方差分析，两两比较采用方差齐性检验，若方差齐性则使用LSD检验，方差不齐采用Dennett t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

从脾脏分离CD4⁺ T细胞，通过流式细胞仪检测提取的正常小鼠脾脏CD4⁺ T细胞的纯度达到92.9%。胎盘蓝染色活细胞率达到98%。

图 2(Figure 2)

图 2 CD4+ T内Smad2和P-Smad2蛋白表达 Figure 2 Expressions of Smad2/P-smad2 in CD4+ T cells

Western blot检测结果显示，TIPE2基因沉默使小鼠脾脏CD4⁺ T淋巴细胞TIPE2表达下调>70%；TIPE2-burn组TIPE2蛋白表达使小鼠脾脏CD4⁺ T淋巴细胞TIPE2表达上调>50%。

CD4⁺ T调亡率TIPE2-burn组凋亡率最高（69.8%），而siTIPE2-burn组CD4⁺ T调亡率为12.33%，与Sham组（10.82%）无统计学差异，但显著低于其余5组（P < 0.01）。

从图 2、3表 1、2可以看出，burn组Smad2/Smad3和P-smad2/P-Smad3较sham组和siTIPE2-burn组升高；siTIPE2-burn组Smad2/Smad3无明显降低，P-smad2/ P-Smad3表达较其余组显著降低（P < 0.05）。TIPE2-burn组Smad2/Smad3较sham组明显升高（P < 0.05），较其余组无统计学意义，P-smad2/P-Smad3表达较其余组显著升高（P < 0.05）。再结合图 4、表 3可见，siTIPE2-burn组Bcl-2的表达升高（P < 0.05），Bim的表达则降低（P < 0.05）。TIPE2-burn组反之。

图 3(Figure 3)

图 3 Western blot检测CD4+ T内Smad3和P-Smad3蛋白表达 Figure 3 Expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T cells

图 4(Figure 4)

图 4 各组小鼠脾脏CD4+ T内Bcl-2/Bim蛋白表达 Figure 4 Expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T cells

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad2/P-Smad2蛋白表达比较 Table 1 Expressions of Smad2/P-Smad2 in CD4+T lymphocytes (Mean±SD) Group Smad2 P-smad2 Sham 1.05±0.20 1.95±0.30 Burn 1.52±0.38* 2.13±0.12* siTIPE2-burn 1.48±0.40 1.77±0.25# siTIPE2-negative-burn 1.53±0.26 2.15±0.46 TIPE2-burn 1.60±0.15# 2.98±0.52Δ TIPE2-negative-burn 1.55±0.51 2.16±0.42 Smad2: *P < 0.05 burn group vs sham and siTIPE2-burn groups. #P < 0.05, TIPE2-burn group vs sham group. P-smad2: *P < 0.05 burn group vs sham and siTIPE2-burn groups; #P < 0.05, siTIPE2-burn group vs burn and TIPE2-burn groups; ΔP < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.

表 1 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad2/P-Smad2蛋白表达比较 Table 1 Expressions of Smad2/P-Smad2 in CD4+T lymphocytes (Mean±SD)

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad3/P-Smad3蛋白表达比较 Table 2 Expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD) Group Smad3 P-smad3 Sham 0.85±0.34 0.95±0.10 Burn 0.92±0.33* 1.10±0.05* siTIPE2-burn 0.78±0.42 0.76±0.15# siTIPE2-negative-burn 0.93±0.56 1.08±0.16 TIPE2-burn 0.98±0.05a 1.48±0.08Δ TIPE2-negative-burn 0.97±0.41 1.09±0.11 Smad3: *P < 0.05 burn vs siTIPE2-burn group; #P < 0.05, TIPE2-burn vs sham group. P-smad3: *P < 0.05 burn vs sham and siTIPE2-burn groups; #P < 0.05 siTIPE2-burn vs burn and TIPE2-burn groups; ΔP < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.

表 2 各组小鼠脾脏CD4+T内Smad3/P-Smad3蛋白表达比较 Table 2 Expressions of Smad3/P-Smad3 in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD)

表 3(Table 3)

表 3 各组小鼠脾脏CD4+T内Bcl-2/Bim蛋白表达比较 Table 3 Expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD) Group Bcl-2 Bim Sham 1.15±0.20 1.06±0.30 Burn 1.22±0.38 1.11±0.12 siTIPE2-burn 1.58±0.40* 0.87±0.25* siTIPE2-negative-burn 1.23±0.26 1.15±0.46 TIPE2-burn 0.90±0.15# 1.48±0.52# TIPE2-negative-burn 1.25±0.51 1.16±0.42 *P < 0.05 siTIPE2-burn vs other groups; #P < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.

表 3 各组小鼠脾脏CD4+T内Bcl-2/Bim蛋白表达比较 Table 3 Expressions of Bcl-2/Bim in CD4+ T lymphocytes (Mean±SD)

siTIPE2-burn组线粒体膜电位为（97.50±2.40）%，较sham组（98.20±1.20）%外其余组比较升高（P < 0.05）。TIPE2-burn组CD4⁺ T内线粒体膜电位为（70.90±1.4）5%，较其余组降低（P < 0.01）。

图 5(Figure 5)

图 5 各组CD4+ T细胞色素C表达 Figure 5 Changes in cytochrome C in CD4+ T cells. The cytochrome C protein was directly labeled as red by the red pigment, and the DAPI was stained with blue. A: Sham; B: Burn; C: siTIPE2-burn; D: siTIPE2-negative-burn; E: TIPE2-burn; F: TIPE2-negative -burn.

siTIPE2-burn组细胞色素C水平为33.50±3.40%，较除sham组（23.20±3.40）%外降低，（P < 0.05）；TIPE2-burn组细胞色素C水平为（51.90±3.41）%，较其余组有所升高（P < 0.05）。

siTIPE2-burn组CD4⁺ T内caspase-3较sham组，burn组，siTIPE2-negative-burn组和TIPE2-negativeburn略降低，但无统计学意义；较TIPE2-burn组降低（P < 0.01），caspase-8、caspase-9活性较其余组降低（P < 0.05）。TIPE2-burn组caspase-3、caspase-8、caspase-9活性较其他组均升高（P < 0.05，表 4）。

表 4(Table 4)

表 4 CD4+T内caspase的活性变化比较 Table 4 Caspase activity of T CD4+ cells in each group (Mean±SD) Group Caspase-3 Caspase-8 Caspase-9 Sham 0.112±0.015 0.009±0.004 0.080±0.008 Burn 0.325±0.007 0.305±0.006 0.405±0.010 siTIPE2-burn 0.272±0.010* 0.122±0.005* 0.122±0.005* siTIPE2-negative-burn 0.347±0.009 0.310±0.008 0.412±0.013 TIPE2-burn 0.560±0.012## 0.485±0.014# 0.604±0.016# TIPE2-negative-burn 0.330±0.009 0.309±0.010 0.410±0.020 Caspase3: *P < 0.05 siTIPE2-burn vs TIPE2-burn group; Caspase8, Caspase9: *P < 0.05 siTIPE2-burn vs other groups; #P < 0.05, TIPE2-burn vs other groups.

表 4 CD4+T内caspase的活性变化比较 Table 4 Caspase activity of T CD4+ cells in each group (Mean±SD)

细胞免疫的状态被认为与脓毒血症的发生和发展密切相关。免疫细胞的凋亡是脓毒症介导免疫抑制的主要原因。动物研究证实脓毒症可以导致严重免疫细胞凋亡。大量动物和人研究证实在脓毒血症外周和脾脏淋巴细胞减少，凋亡是淋巴细胞减少的主要的机制。防止T淋巴细胞凋亡可以增强宿主抵抗脓毒血症的能力。有研究发现抗凋亡免疫治疗可以改善其生存率。因此，T淋巴细胞凋亡机制和凋亡预防是脓毒症新的研究及治疗靶点^[9-12]。降低脓毒症死亡率需要从预防免疫T细胞减少，加速其功能恢复，阻断免疫抑制通路的研究着手^[13-14]。业已明确，脓毒症时调节T细胞通过膜结合TGFβ1通路，参与了效应T细胞的凋亡^{[15-16, 18]}。其中线粒体通过释放凋亡基因在凋亡中起着关键性作用^{[17, 19]}。

2008年Sun等^[5]发现TIPE2以来，越来越多的证据证实TIPE2在维持免疫稳态中起着重要作用。主要通过Toll样受体信号通路和T细胞受体进行调节，另据报道小剂量内毒素攻击小鼠模型，与正常野生型组相比，TIPE2基因敲除组出现明显休克反应^[5]。研究说明TIPE2在急、慢性炎症病理过程中具有潜在调节效应^{[5-6, 20]}。有趣的是TIPE2在炎症组织中高表达，在正常组织少量表达或无表达^[21-22]。因此推测TIPE2是防止机体过度免疫反应和维持免疫稳态的重要调节器。TIPE2与TNFAIP8家族其它成员有基因同源性，其被认为有调节凋亡的功能^[23-25]。有资料证实，内毒素刺激巨噬细胞TIPE2可下调多条炎症相关信号转导通路，减弱转录因子激活蛋白-1的活性。并且TIPE2基因缺陷细胞呈现对TLR和T细胞受体信号活化的高反应性^{[5, 20, 26]}。TIPE2参与机体免疫动态平衡调控过程的分子机制可能与其结合caspase-8有关。先前研究证实TIPE2蛋白存在于CD4⁺ T细胞的胞浆中，沉默TIPE2基因表达后，小鼠脾T淋巴细胞增殖反应明显增强，凋亡减少，提示TIPE2的表达可促进T淋巴细胞的凋亡^[7-8]，我们推测TIPE2参与了TGF-β1信号通路介导CD4⁺ T细胞凋亡过程。本研究旨在探讨通过体内实验siRNA沉默TIPE2表达下调对急性损伤后CD4⁺ T细胞介导的凋亡的影响。

本研究发现，burn组Smad2/Smad3磷酸化明显增强，TIPE2基因沉默能够抑制Smad2/Smad3的活化。结果提示沉默TIPE2基因表达后，降低了小鼠脾T淋巴细胞TGFβ1下游信号分子Smad2/Smad3活化，从而降低CD4⁺ T内促调亡蛋白Bim表达，促进抗调亡蛋白Bcl-2表达，从而降低了小鼠脾T淋巴细胞的凋亡。反推TIPE2可以减少脓毒症Bcl-2蛋白表达，增加Bim蛋白表达，提示TIPE2作为一种重要的负向调控分子，具有促进正常及烧伤后脓毒症小鼠脾CD4⁺ T淋巴细胞凋亡的作用，机制可能通过活化的TGFβ1使Smad2/ Smad3发生磷酸化而被激活，受到Bcl-2家族的促凋亡和抗凋亡蛋白的调节，通过细胞色素C的释放caspase-9。最终活化的caspase-8、caspase-9都通过激活下游的caspase-3介导T细胞的调亡。

总之，TIPE2作为一种重要的负向调控分子与机体细胞免疫功能异常密切相关，很可能是体内关键的细胞免疫调节因子之一，其确切作用及关键环节值得深入探讨。本研究证实TIPE2促进严重烧伤后脾脏T淋巴细胞的凋亡，这对于从新的角度深入认识TIPE2在烧伤脓毒症发病中的地位具有重要理论意义和临床价值，并通过小RNA干扰技术可对TIPE2表达进行干预，为脓毒症免疫机制和诊治研究提供新方向。今后仍需进一步扩大样本量，对其结论进行充分验证。