常用的静脉麻醉药丙泊酚对宫颈癌、纤维肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的侵袭力有抑制作用^[1-3]。水通道蛋白家族（AQPs）是一类介导跨膜水运输的内在蛋白^[4]，其中AQP-3在非小细胞肺癌（NSCLC）和肺腺癌细胞中高表达^[5-6]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类以无活性酶原形式分泌的Zn2+±赖的肽链内切酶，其中MMP-9即明胶酶B被认为是肺癌细胞侵袭和转移的重要分子，在NSCLC患者的血清、肺组织中MMP-9 高表达^[7-9]。研究表明，丙泊酚能抑制肺癌A549细胞AQP-1的表达，抑制其生长和迁移^[10]；AQP-3可参与早期肺腺癌发展过程、调节肺癌细胞生物学功能^[11]。丙泊酚对A549细胞AQP-3和MMP-9表达的影响尚不清楚。本研究通过观察丙泊酚对人肺癌A549细胞侵袭力及AQP-3、MMP-9 的影响，探讨丙泊酚对A549细胞的作用及机制。

大学珠江医院肿瘤科实验室，A549细胞用10%胎牛血清DMEM/F12培养基，在37℃、5% CO₂恒温培养箱培养，每2~3d换液。选择对数生长期的A549细胞用于实验。

DEME/F12 培养基购于HyClone，胎牛血清购于Gibco，PCR引物由上海英潍捷基公司合成，β-actin、AQP-3 抗体购自Abcam；MMP-9 抗体购自CST，山羊抗兔IgG二抗购于Jackson，丙泊酚纯品、二甲基亚砜（DMSO）、CuSO₄ 分析纯级购于Sigma，Transwell小室和Matrix基质胶购于Corning。

实验分6组：空白对照组（C组），加入等体积的PBS；DMSO溶剂组（D组），加入同体积的DMSO溶剂，总浓度不超过0.1%；丙泊酚分为25 μmol/L（P₂₅组）、50 μmol/L（P₅₀组）、100 μmol/L（P₁₀₀组）；AQP-3抑制剂CuSO₄组（Cu组500μmol/L。

按丙泊酚作用时间和剂量分为10组：时间分组为12 h组和24 h组，剂量分组为C组、D组、P₂₅组、P₅₀组、P₁₀₀组。细胞株传代培养3 d，加药物刺激作用后收集细胞。用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取1 μg RNA进行逆转录42℃，2min。取适量cDNA产物进行荧光定量PCR，扩增条件95 ℃持续5 s，60 ℃持续60s，共40个循环。PCR引物序列从GeneBank 数据库中查找：AQP-3 上游引物${{5}^{'}}$-TCAATGGCTTCTTTGACCAGTTCA-${{3}^{'}}$，下游引物${{5}^{'}}$-CTTCACATGGGCCAGCTTCACATT-${{3}^{'}}$；β-actin上游引物${{5}^{'}}$-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-${{3}^{'}}$，下游引物${{5}^{'}}$-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-${{3}^{'}}$。以β-actin作为内参基因，计算AQP-3 mRNA 的相对表达量（β-actin/AQP-3），用2^-ΔΔCT来评价目标mRNA的表达水平。β-actin可用来校加样误差。

按上述丙泊酚作用时间和剂量分为10组，加500 μmol/LCuSO₄ 2 h处理组（Cu组）。收集处理过的细胞，提取总蛋白，BCA 法测蛋白浓度，计算上样量。制备12%SDS-PAGE凝胶，每孔加50 μg蛋白样品，进行电泳。转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，1%TBST洗膜3次，加入一抗AQP-3（1∶200）、MMP-9（1∶500）、β-actin（1∶1000），共同孵育4 ℃恒温过夜。洗膜后于左右摇床上室温孵育二抗（山羊抗兔抗体：1∶3000），2 h。采用ECL发光试剂盒发光、显影，使用凝胶图像分析系统采集图像，图像采集后使用Image J软件处理系统分析目标条带的光密度值。

饥饿A549细胞24 h后，按上述实验分组处理细胞，消化收集，调整细胞悬液浓度为5×10⁵/mL。每个上室加入200 μL细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的培养基，放入37 ℃，5%CO₂的细胞培养箱中孵育24 h。用棉签擦去上室内面的细胞和基质胶，无水甲醇固定20 min，PBS洗涤，风干后0.1%结晶紫染色细胞20 min，PBS洗涤3~4次。棉签擦净残留在小室内壁的细胞和液体，静置待小室风干。将Transwell 小室膜朝上，在200倍镜的正置显微镜下观察，随机选5个视野，计数细胞数。

用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示。实验结果数据采用单因素方差分析。组间两两比较：方差齐采用LSD分析，方差不齐用Dunnet${{\text{t}}^{'}}$sT₃分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

AQP-3 mRNA变化与C组的比值分别为：D_12h组0.91±0.015，D_24h组0.78±0.020，P_25~12h组0.65±0.027，P_25~24h组0.41±0.031，P_50~12h组0.52±0.047，P_50~24h组0.25±0.071，P_100~12h组0.19±0.027，P_100~24h组0.13±0.035。除D_12h组，其余组与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，图 1A）。AQP-3蛋白表达变化与空白组的比值分别为：D_{24 h}组0.78±0.025，P_{25~24 h}组0.91±0.009，P_{50~24 h}组0.60±0.020，P_{100~24 h}组0.57±0.006，Cu组0.51±0.074。与空白组比较各组差异均有统计学意义（P＜0.05，图 1B，图 C）。P_{50~24 h}组、P_{100~24 h}组和Cu组AQP-3蛋白表达明显下降，3者间无显著性差异。

图 1(Figure 1)

图 1 丙泊酚对A549细胞AQP-3 mRNA和蛋白表达的影响 Figure 1 Effect of propofol on AQP-3 expressionin A549 cells.A: AQP-3 mRNA expression in A549 cells; B, C: AQP-3protein expression in A549 cells treated with propofol for24 h. *P＜0.05 vs control cells; #P＜0.05 vs CuSO4 group.

与空白组比较，D组（1.28±0.011）和P_{25~24 h}组（1.12±0.014）MMP-9 蛋白表达有所增加。P_{50~24 h}组（0.65 ±0.006）、P_{100~24 h}组（0.46±0.021）MMP-9蛋白水平较对照组相比表达量有显著下降（P＜0.05），两处理组间差异有统计学意义。并且与Cu组（0.94±0.023）比较，P_{50~24 h}组、P_{100~24 h}组对A549 细胞MMP-9蛋白表达抑制作用明显增加，且差异有统计学意义（P＜0.05，图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 丙泊酚对A549细胞MMP-9蛋白表达的影响 Figure 2 Effect of propofol on MMP-9 protein expression in A549 cells. A: Protein expression of MMP-9 in A549 cells treated with propofol for 24 h measured by Western blotting; B: Quantitative analysis of MMP-9 protein level in A549 cells treated with propofol for 24 h. *P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 vs CuSO4 group

不同浓度丙泊酚处理24 h对A549细胞的侵袭力均有抑制作用。随丙泊酚作用浓度增加，其对侵袭力的抑制增强。A549 细胞各实验组穿膜数分别为C 组199.33±23.88，D组146.22±14.82，P₂₅组122.55±17.20，P₅₀组96.33±5.82，P₁₀₀组74.33±2.85。细胞侵袭抑制比值分别为：D组73.36%、P₂₅组61.48%、P₅₀组48.33%、P₁₀₀组37.29%。各处理组和对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05，图 3）。

图 3(Figure 3)

图 3 Transwell侵袭实验检测A549细胞侵袭力 Figure 3 Invasion of A549 cells evaluated by Transwell invasion assay. A: Cells treated with propofol for 24 h. The invasive cells were stained with crystal violet (Original magnification: ×200); B: Number of invasive cells. *P＜0.01 vs control group; #P＜0.01 CuSO4 group.

Cu组使用500 μmol/L CuSO₄，处理2 h，Transwell实验C组和Cu组穿膜细胞数分别为199.33±19.75 和103.11±13.68，差异有统计学意义（P＜0.05，图 3）。

Cu组AQP-3 和MMP-9 蛋白表达与空白组比较，分别为0.51±0.074 和0.94±0.023，差异有统计学意义（P＜0.05，图 4）。

图 4(Figure 4)

图 4 CuSO4对A549细胞AQP-3、MMP-9蛋白表达的影响 Figure 4 Effect of CuSO4 on protein expression of AQP-3 and MMP-9 in A549 cells. A: Results of Western blotting; B: Quantitative analysis of AQP-3 and MMP-9 protein level in A549 cells. *P＜0.05 vs control group.

AQPs是一类跨膜转运通道蛋白，根据其通透性不同分为水通道和水-甘油通道两类，AQP-3 属于后者。AQPs与肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移力和血管生成有密切关系^[12]。在NSCLC中尤其是肺腺癌和高分化乳头状支气管肺泡癌中，AQP-3高表达^{[5, 11-12]}。研究表明，丙泊酚通过降低AQPs的表达，发挥其器官保护作用：丙泊酚可减少AQP-4、MMP-9及pJNK的表达，减缓脑缺血再灌注损伤^[13]；可以减少神经胶质瘤术后脑水肿患者AQP-4 的表达^[14]；还可下调LPS引起的AQP-2、TNF-α和ICAM-1的表达，对内毒素引起的肺损伤和肾损伤有保护作用^[15]。另有研究发现，丙泊酚能抑制A549肿瘤细胞AQP-1的表达，对A549细胞的生长、迁移有明显抑制作用，并诱导肿瘤细胞的凋亡^[10]；AQP-3可能参与早期肺腺癌发展过程、调节肺癌细胞生物学功能^[11]。迄今，丙泊酚对A549肿瘤细胞（非小细胞肺癌）AQP-3作用的影响，尚未明确。本研究，采用体外培养人肺腺癌A549 细胞株，测定不同浓度和作用时间的丙泊酚对A549细胞AQP-3 mRNA和蛋白表达的影响。结果发现，12 h和24 h丙泊酚低、中、高剂量组AQP-3 mRNA表达均明显减少，24 h丙泊酚低、中、高剂量组AQP-3蛋白表达均明显减少，表明丙泊酚对人肺癌A549 细胞AQP-3的表达有抑制作用，且呈时间-剂量依赖性。

MMPs可以降解、破坏基底膜和细胞外基质（ECM），促进血管表面生长因子的释放参与肿瘤血管形成和肿瘤生长^[16]，其中MMP-2和MMP-9与多种肿瘤的侵袭转移关系最为密切^[17]。MMP-9以酶原形式分泌至胞外，主要存在于单核-巨噬细胞内，在恶性细胞株中的表达增加与肿瘤细胞的转移能力相关^[18]。MMP-9被认为是肺癌细胞侵袭和转移的重要分子，NSCLC患者的血清、肺组织中MMP-9水平显著增高^[7-8]。抑制肺癌细胞MMP-9的表达，能够减少肺癌早期转移并且可破坏肿瘤的脉管系统，达到抗肿瘤的作用^[19]。Meta分析表明，非小细胞肺癌MMP-9免疫组化染色结果阳性的患者5年生存率低于结果阴性者^[9]，提示MMP-9在NSCLC患者预后中的重要作用。本研究，中、高剂量丙泊酚组（50、100 μmol/L）MMP-9蛋白表达明显减少，表明丙泊酚可以抑制人肺癌A549细胞MMP-9蛋白表达，然低剂量丙泊酚组（25 μmol/L）的MMP-9蛋白表达较C组增加。有研究报道，丙泊酚34 μmol/L可以促进人乳腺癌MDA-MB-468 细胞迁移^[20]；丙泊酚0~40 μmol/L呈剂量-时间±赖性促进胆囊癌GBC-SD细胞增殖、侵袭，并抑制细胞凋亡^[21]；低剂量（15、20、25 μg/mL）丙泊酚处理24 h对A549细胞MMP-9蛋白表达为促进作用，而处理48 h为抑制作用^[22]。可见，中、高剂量的丙泊酚对肿瘤细胞侵袭力的抑制作用更确切，低剂量的丙泊酚对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响有待进一步验证。除剂量因素外，丙泊酚对不同肿瘤细胞侵袭转移能力的影响是否不同，值得探讨。

对其作用机制的研究发现，敲除人非小细胞肺癌A549细胞的AQP-3基因，可以通过AKT/MMPs途径降低肺癌细胞的侵袭力，并且AQP-3表达下调能抑制肿瘤细胞甘油摄取和线粒体ATP生成^[23]；可以延迟肿瘤细胞的生长，可能与阻止HIF-1α/VEGF和Raf/MEK/ERK信号通路有关^[24]。本研究表明，丙泊酚50、100 μmol/L处理24 h，可下调人肺癌A549 细胞AQP-3 mRNA、AQP-3 蛋白和MMP-9 蛋白的表达，抑制A549 细胞的侵袭力。但是，丙泊酚是否通过下调AQP-3表达影响AKT和ERK信号通路，从而抑制人肺癌A549 细胞的MMPs表达和细胞侵袭力，其作用机制还有待深入研究。CuSO₄ 是AQP-3 特异性抑制剂^[25]，500 μmol/LCuSO₄作用2 h可明显抑制肿瘤细胞的侵袭力和AQP-3的蛋白表达^[26-30]。本实验CuSO₄组明显减少肺腺癌A549细胞AQP-3和MMP-9蛋白的表达，对A549细胞的侵袭力有明显的抑制作用，进一步说明通过减少肺癌A549细胞的AQP-3表达可以抑制MMP-9表达和肿瘤细胞的侵袭力。

本研究表明，50、100 μmol/L丙泊酚可下调人肺腺癌A549细胞AQP-3和MMP-9的表达，抑制A549细胞的侵袭，为肿瘤手术患者麻醉方式和药物的选择提供实验±据。关于丙泊酚下调A549细胞AQP-3和MMP-9表达的具体机制、通路，以及丙泊酚对肿瘤转移机制的动物实验、临床观察，均值得进一步探讨。