CDK6是一个关键性的细胞周期因子，位于人类七号染色体上，包含7个外显子，编码38 kD的蛋白质。该基因与CDK6、CCND1结合成复合物，进一步诱导RB蛋白磷酸化，从而诱导细胞周期由G1 向S 期转化。Mb1umbres等研究显示，在体内敲除CDK6和CDK4基因后，小鼠在胚胎时期将会死于严重的贫血^[1]，该研究显示了CDK6对于发育的重要性。

在以往的研究中，CDK6 过表达已经展示在许多肿瘤中，显示了其对于肿瘤发病过程的重要性。Timmermann等^[2]发现，与正常黏膜相比，CDK6在鳞状口腔癌中的活性明显增高，利用CDK6 抑制剂，抑制cyclin-CDK-Rb通路激活，从而逆转上皮异常增生。除此之外，CDK6在慢性B淋巴细胞性白血病、髓母细胞 瘤以及粘液纤维肉瘤中表达增高^[3-5]。罗小鹏等^[6-7]也发现，CDK6在鼻咽癌组织中表达升高，且抑制其表达后，能抑制细胞周期进展和细胞生长。在膀胱癌中，CDK6表达明显比癌旁组织高，并与膀胱癌的侵袭和分级明显呈正相关^[8]。在很多肿瘤中，CDK6被不同的miRNAs（mir-105、miR-29c、miR-340、miR-124a）^[9-12]靶击，导致其表达下调，从而抑制肿瘤细胞生长。以上这些研究建议CDK6在肿瘤发生发展过程中发挥了重要作用。然而，CDK6在卵巢癌中的表达与临床参数和预后的关系目前还没有相关报道。为明确CDK6在CDK6在卵巢癌在作用，我们检测了CDK6在卵巢癌组织中表达，并分析其表达与卵巢癌临床病理参数和预后的相关性。

收集贵州省妇幼保健院病理科2007年1月~2014 年1月收集121例Ⅰ~Ⅱ期上皮性卵巢癌和48例卵巢石 蜡组织标本。患者年龄23~82岁。另外，我们还收集了 2014年1月~2015年12月36例新鲜上皮性卵巢癌和16 例卵巢手术切除标本，液氮立即保存。

逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日 本Takara公司。Trizol购自美国Invitrogen公司。免疫 组化SP法试剂盒购自福建迈新公司。

常规Trizol 提取总RNA。总RNA 随即被逆转录 成cDNA，反应条件如下：总RNA 1 μg 与2 μL dNTP mix（10 mmoL）和2 μL oligo（dT）18（0.5 μg/μL）及无 RNA酶的去离子水共13.5 μL混匀，离心。70 ℃变性 5 min，室温静置2 min。然后依次添加5×Buffer 4 μL， 0.1 moL DTT 1 μL，RNase 抑制剂（40 U/μL）0.5μL，逆 转录酶（200 U/μL）1 μL，混匀，离心，放入42 ℃水浴中 反应1 h，95 ℃灭活5 min。-20 ℃冷冻备用。

实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, QPCR）在胃癌组织中扩增NDRG1和E-cadherin基因， 反应体系为SYBR Premix Ex（2×）10 μL、，上下游引物 （10 μmoL）各0.4 μL、，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL、cDNA 模板1 μL 和灭菌去离子水7.8 μL 共 20 μL。反应条件如下：94 ℃变性2 min；94 ℃变性10 s； 55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15s，45个循环；最后，产物在 72 ℃延伸5 min，溶解曲线分析。CDK6引物见^[3]。内参 照引物为Beta actin，正义引物：5'-CACCCAGCACA ATGAAGAT-3'，反义引物：5'-CAAATAAAGCCATG CCAAT-3'，全长255 bp。引物由上海英骏公司合成。 实验重复3次。

取卵巢癌和卵巢石蜡切片置于60 ℃烤箱烘烤2 h；依次将切片按顺序浸入二甲苯中各脱蜡20 min后将切片按顺序浸入不同梯度酒精中水化2 min，然后置于超 纯水中待用；将切片放入盛有柠檬酸盐抗原修复液的孵育槽中，然后高压锅中高温高压修复2 min，室温自然冷 却；滴加卵白素，室温孵育10 min；PBS洗5 min×3次； 滴加d-生物素溶液，室温孵育10 min；PBS洗5 min×3 次；滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育15 min； PBS 洗3 min×3 次后10%山羊血清封闭，室温孵育 10 min，弃血清；滴加1∶100 稀释CDK6 抗体（美国 Santa Cruzbiotechnology公司），4 ℃孵育过夜；PBS洗 5 min×3次后滴加二抗（生物素标记的羊抗兔IgG）室温 孵育10 min；PBS 洗3 min×3 次后滴加链霉素抗生物 素蛋白-过氧化物酶溶液，室温孵育l0 min；PBS 冲洗 3 min×3次后滴加新鲜配制的DAB液于切片中，显微镜 下观察，显色约20s后，置于水中中止显色；苏木素复染，流水冲洗返蓝15 min；切片依次浸入不同浓度酒精中脱水各2 min后在二甲苯中各透明，中性树胶封片，显微镜下观察染色效果。

免疫组化评分分别采取了胞浆和胞核单独进行，具 体评分标准详见^[13]。最后每张切片CDK6表达量评分 采用如下公式：蛋白表达量综合计分=胞浆评分+胞核评 分。总分为12分；高表达：≥7分；低表达：＜7分。

采用SPSS20.0统计分析软件包进行数据处理。非 配对T检验用于分析CDK6 mRNA在卵巢癌与卵巢组 织之间的表达差异。CDK6蛋白表达与临床参数相关 性采用χ²检验。生存预后分析采用Kaplan-Meier。Cox 模型用于评估CDK6表达作为影响患者生存的独立预 后因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

实时荧光定量PCR检测了36例卵巢癌和16例卵巢 组织CDK6 mRNA表达水平，结果显示，与卵巢组织相比， CDK6在卵巢癌组织中表达明显上调（图 1，P=0.0063）。

图 1(Figure 1)

图 1 CDK6 mRNA在卵巢癌组织癌组织中表达上调 Figure 1 CDK6 mRNA was upregulated in ovarian cancer tissues.

我们利用免疫组化检测了121例卵巢癌组织和48 例卵巢组织中CDK6蛋白表达。结果显示，CDK6蛋白 在卵巢癌组织和卵巢组织中均能检测其表达。除此 之外，CDK6 蛋白在两种组织中显示为核浆共表达因 子（图 2）。

图 2(Figure 2)

图 2 CDK6在卵巢癌及卵巢组织中表达 Figure 2 Expression of CDK6 in ovarian cancer tissues and normal ovarian tissue (Original magnification: ×400). A: Low expression of CDK6 in normal ovarian tissue; B: CDK6 expression in the cytoplasm of ovarian cancer tissue; C, D: Coexpression of CDK6 in the cytoplasm and nuclei in ovarian cancer tissue.

免疫组化分析了121例卵巢癌组织和48例卵巢组 织中CDK6蛋白表达差异。结果显示，与正常卵巢组织相 比，CDK6蛋白在卵巢癌中表达明显上调（表 1，P=0.044）。

表 1(Table 1)

表 1 CDK6在卵巢癌中表达上调 Table 1 Elevated expression of CDK6 protein in ovarian cancer Tissue n CDK6 expression P High Low Ovarian cancer 121 34 87 0.044 Ovarian tissues 48 6 42

表 1 CDK6在卵巢癌中表达上调 Table 1 Elevated expression of CDK6 protein in ovarian cancer

统计分析显示，过表达的CDK6与卵巢癌患者年龄、 病理类型、分化程度以及临床分期无明显关系（表 2）。 CDK6表达越高，患者综合生存时间越短（图 3，P=0.006）。

表 2(Table 2)

表 2 CDK6表达与卵巢癌临床参数相关性分析 Table 2 Correlation of CDK6 expression with clinical features of patients with ovarian cancer Clinical parameter n CDK6 of expression P High expression (n) Low expression (n) Age (year) ≥50 55 15 40 1.0 ＜50 66 19 47 Pathological classification S 87 28 62 0.252 M 31 6 25 Grade Low 44 9 35 0.276* Middle 65 20 45 High 12 5 7 Clinical stage Ⅰ 101 22 79 0.096 Ⅱ 26 12 8 *Kruskal-Wallis test

表 2 CDK6表达与卵巢癌临床参数相关性分析 Table 2 Correlation of CDK6 expression with clinical features of patients with ovarian cancer

图 3(Figure 3)

图 3 CDK6表达升高诱导卵巢癌患者不良预后 Figure 3 Increased CDK6 expression is associated with a poor prognosis of ovarian cancer patients.

进一步我们利用Cox模型评估CDK6在卵巢癌中 作为独立预后因子的可能性。单变量和多变量分析结 果都显示，CDK6表达是影响卵巢癌患者预后的独立性 因素（表 3）。

表 3(Table 3)

表 3 单变量和多变量Cox回归模型综合生存分析总结 Table 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival of the patients Parameter Univariate analysis Multivariate analysis P HR 95% CI P HR 95% CI Age (year) ≥50vs＜50 0.082 2.024 0.915-4.479 0.046 2.334 1.013-5.375 0.685 Clinical stage ⅠvsⅢ 0.042 2.340 1.030-5.316 0.167 1.885 0.767-4.633 Pathological classification SvsM 0.918 1.046 0.444-2.465 0.240 1.771 0.682-4.600 Grade Low vs middle vs high 0.694 1.123 0.631-1.998 0.915 1.033 0.560-1.876 CDK6 expression Low vs high 0.009 2.700 1.286-5.666 0.025 2.440 1.119-5.319

表 3 单变量和多变量Cox回归模型综合生存分析总结 Table 3 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival of the patients

细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自 身的稳定。细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱，从而诱导肿瘤的发生^[14-17]。

CDK6是一个关键的细胞周期促进因子，参与诱 导肿瘤细胞的增殖^[18-19]。在卵巢癌中能被miR-211直接 抑制，参与了卵巢癌的发病过程^[20]。然而，CDK6表达 模式以及与卵巢癌临床病理参数之间的关系一直没有 明确。在这次研究中，为了明确CDK6在卵巢癌中的作 用，我们首先利用实时荧光定量PCR 的方法检测了 CDK6 在卵巢癌与卵巢组织中的表达。结果显示， CDK6 mRNA在卵巢癌组织中表达明显上调。进一步， 免疫组化分析显示，CDK6是一个核浆共表达因子。与 mRNA表达水平类似，CDK6蛋白表达水平在卵巢癌组 织中也明显升高。该结果相似于Baba^[21]和罗小鹏^[6]等 在食道癌和鼻咽癌中的报导，建议CDK6在卵巢癌中发 挥了重要的作用。

在以前的研究中，CDK6表达升高与食道癌和粘液 纤维肉瘤等肿瘤的临床进展密切相关。与这些研究结 果不一致的是，在我们的结果中，并没有发现过表达的 CDK6与早期卵巢癌患者的临床参数包括患者的年龄、临床分期、分化程度、病理类型等相关。但我们观察到 过表达的CDK6与早期卵巢癌患者的预后呈明显负相 关。CDK6表达越高，卵巢患者预后与差。反之，CDK6 表达越低，则患者预后越好。该结果与Tsai^[5]等报道相 似，提示过表达的CDK6导致了卵巢患者不良预后。最后，我们基于Cox模型分析还发现，CDK6表达可以作 为预测卵巢癌独立预后因素，这进一步表明了CDK6在 卵巢癌发病过程的重要性，并提示CDK6可以作为一个 潜在的基因治疗靶标用于卵巢癌的治疗。目前，针对 CDK6 与CDK4 复合物的抑制剂PD-0332991 已经开 发，能明显抑制肿瘤细胞生长^[22-25]。综合以上结果，我们认为，CDK6是一个重要候选癌基因，其表达上调在卵 巢癌发病和导致不良的预后方面发挥了重要的作用。 因此，变异的CDK6表达能作为早期卵巢癌发病的一个 恶性标志物。