类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症为主要病理特征。引起RA发生的早期事件仍未清楚，但抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPAs）的形成被认为是其关键的致病事件，因为RA相关的致病性自身抗体先于临床症状出现^[1] 。近来有研究指出中性粒细胞胞外网状陷阱（NETs）是瓜氨酸化自身抗原的来源且其本身可能是自身抗体的靶点^[2-3] 。RA患者中性粒细胞能通过一种新的死亡方式即NETosis 自发形成NETs^[4] ，使瓜氨酸化的波形蛋白和ɑ-烯醇化酶外化，此外还能诱导成纤维滑膜细胞表达和分泌促炎症细胞因子如IL-8等，反过来又可进一步增强NETosis^[5] ，扩大瓜氨酸化自身抗原暴露和促进易感个体自身抗体形成。体外形成的NETs能被脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）和健康者血浆降解，而自身血浆则不能或不完全能降解^[6-7] ，说明体内NETs降解受损可能与DNaseⅠ异常有关。DNaseⅠ活性受损与狼疮性肾炎相关也支持了该观点^[8-9] 。NETosis在RA中是增强的，如果DNaseⅠ活性存在异常而不能有效降解NETs，势必会增加NETs的暴露，加重ACPAs 的异常形成，且进一步诱发炎症反应而使关节炎症恶化。本研究拟通过测定血清和关节液DNaseⅠ活性，分析其活性是否存在异常及与NETs 在RA 致病是否相关。并对关节液中NETs 标记物（cfDNA）进行测定，进一步分析DNaseⅠ与NETs的关系。DNaseⅠ活性异常可能是RA发病中的一个中心环节，因此对其机制的阐明能为RA治疗提供新的理论基础。

纳入我院住院RA患者83例，其中女性63例，男性20 例，年龄27~86 岁，平均59±13 岁，所有患者均符合1987年ACR修订的RA分类诊断标准。同期纳入年龄和性别匹配健康对照者60名。血清标本来自以上患者和健康者。关节液来自2014年7月~2015年11月我院住院和门诊患者，其中RA患者27例，女性23例，男性4例，年龄22~68 岁，平均53±11 岁；OA患者23 例，女性16例，男性7例，年龄42~80岁，平均57±11岁；AS患者9例，女性4例，男性5例，年龄17~46岁，平均27±10岁；GA患者6例，全为男性，年龄33~64岁，平均44±11岁。

血清标本采集：清晨空腹抽取RA和健康者全血5 mL，3000 r/min离心10 min，分离血清并取0.5 mL分装后-30 ℃冻存，用于检测血清DNaseⅠ活性。关节液标本采集：膝关节穿刺术抽取RA和其他炎症性关节炎患者关节液，300 r/min 离心10 min 后取上清液放入Eppendorf管-80 ℃保存待测。收集RA患者标本采集时的临床资料，包括病程、ESR、CRP、DAS28评分、中性粒细胞计数、RF和抗CCP抗体。

采用辐射状酶扩散法测DNaseⅠ活性。该法基于对底物dsDNA的降解，配制含有dsDNA（Sigma）和核酸染料Sybr Green（Sigma）的琼脂糖（Biowest）凝胶，用血清/关节液扩散降解底物dsDNA后用凝胶成像系统测量扩散面积。具体步骤为：牛甲状腺dsDNA 用蒸馏水溶解为5 mg/mL的溶液，取1.86 mL的dsDNA溶液加入18.14 mL 的DNaseⅠ缓冲液（10 mmol/L Tris-HClpH7.5，10 mmol/L MgCl₂，2 mmol/L CaCl₂和50 mmol/LNaCl）中，并加入电泳级Sybr Green（1/1000）10 μL，混匀后加热至40~50 ℃。同时用DNaseⅠ缓冲液配制20 mL的2%的琼脂糖凝胶，待温度降至40~50 ℃时与配制好的dsDNA混合液混匀，将胶倒入96孔细胞培养板的板盖中，待胶凝固后在每孔中央用10 μL吸头加入2 μL 血清/关节液，用已知浓度的DNaseⅠ配制标准品，每孔加入从1.1 U/mL 倍比稀释到0.034 U/mL 的DNaseⅠ标准品各2 μL，胶用自封袋封口后避光37 ℃温箱孵育12 h。采用PCR凝胶成像系统拍照，IPP6.0软件定量分析。

采用PicoGreen 试剂盒测定关节液cfDNA 含量。该法基于荧光核酸染料PicoGreen 可特异性结合dsDNA，结合后经488 nm荧光激发后可发出520 nm 荧光，荧光酶标仪可准确读数。用已知浓度的LambdaDNA作为标准品，根据标准品可推算出样品浓度。简要步骤为：经离心的关节液稀释40倍后取100 μL加入黑色96 孔微孔板，加入经200 倍稀释的PicoGreen 100 μL，室温孵育10 min后使用荧光酶标仪测定荧光值。

采用Graphpad Prism5 软件制图，SPSS 19.0 软件进行分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较应用独立样本t检验；不满足正态分布的计量资料用M（P₂₅，P₇₅）表示，组间比较应用Mann-Whitney U 检验；两变量之间的相关性应用Pearson 和Spearman相关分析。P＜0.05认为差异有统计学意义。

RA 血清DNase Ⅰ活性显著低于健康对照组（0.3065±0.1436 U/mL vs 0.4289±0.1976 U/mL，P＜0.001），差异有统计学意义（图 1A）；进一步分析RA 血清DNase I 活性与临床指标的相关性发现其与ESR（r=-0.2862，P=0.0122，图 1C）、CRP（r=-0.2790，P=0.0184，图 1D）和中性粒细胞计数（r=-0.287，P=0.011）呈负相关，而与DAS28（r=-0.1324，P=0.2544，图 1B）、RF、抗CCP抗体无关（表 1）。

图 1(Figure 1)

图 1 血清DNase I活性分布及其与疾病活动的关系 Figure 1 Distribution of serum DNase I activity and its relationship with disease activity.

表 1(Table 1)

表 1 RA血清DNaseⅠ活性与临床指标的相关性 Table 1 Correlation between serum DNase I activity of RA and clinical parameters Duration ESR CRP DAS28 Neutrophil cell counts RF Anti-CCP antibody r -0.039 -0.2862 -0.2790 -0.1324 -0.287 -0.140 0.026 P 0.735 0.0122 0.0184 0.2544 0.011 0.295 0.883 n 78 76 71 76 78 58 35

表 1 RA血清DNaseⅠ活性与临床指标的相关性 Table 1 Correlation between serum DNase I activity of RA and clinical parameters

活性关节液中DNaseⅠ活性的测定同样采用辐射状酶扩散法，该法基于测定DNaseⅠ降解琼脂糖凝胶的面积来推算其活性。由于根据标准品计算出的DNaseⅠ活性在炎症性关节炎中只有2例阳性，其中1例为RA，1例为OA，故通过比较DNaseⅠ降解琼脂糖的面积大小来比较各组间是否有差异。如图 2A所示，DNaseⅠ活性在各组间无统计学差异。可见DNaseⅠ在这些炎症性关节炎关节液中几乎是无活性的。

图 2(Figure 2)

图 2 关节液DNase I和cfDNA分布以及cfDNA和炎症指标间的相关性 Figure 2 Distribution of synovial fluid DNase I and cfDNA and the correlation between cfDNA and inflammatory markers.

RA组关节液cfDNA水平显著高于OA组（100.81±142.98 μg/mL vs 18.98±31.40 μg/mL，P=0.002，图 2B），其水平与病程、ESR、CRP、DAS28、中性粒细胞计数、RF-IgG、RF-IgA、RF-IgM及抗CCP抗体无关（表 2）。RA组关节液cfDNA水平较AS组（45.85±47.67 μg/mL，P=0.428）高，较GA 组（162.95±97.49 μg/mL，P=0.132）低，但差异均无统计学意义。与OA组和AS组相比，GA组cfDNA 水平显著升高（162.95±97.49 μg/mL vs 18.98±31.40 μg/mL，P＜0.001）；（162.95±97.49 μg/mL vs 45.85 ± 47.67 μg/mL，P=0.008）；而OA 和AS 组间cfDNA水平无差异。对所有炎症性关节炎患者关节液cfDNA水平与炎症指标间的相关性分析发现其水平与ESR（r=0.4106，P=0.0116）和CRP（r=0.5747，P=0.0002）呈显著正相关（图 2C，D）。

表 2(Table 2)

表 2 RA关节液cfDNA水平与临床指标的相关性 Table 2 Correlation between synovial fluid cfDNA level and clinical parameters in RA patients Duration ESR CRP DAS28 Neutrophil cell counts RF-IgG RF-IgA RF-IgM Anti-CCP antibody r 0.164 0.151 0.336 -0.231 0.406 0.327 0.296 0.465 0.032 P 0.477 0.513 0.136 0.389 0.067 0.275 0.519 0.052 0.898 n 21 22 22 16 22 13 7 18 19

表 2 RA关节液cfDNA水平与临床指标的相关性 Table 2 Correlation between synovial fluid cfDNA level and clinical parameters in RA patients

我们的研究发现血清DNaseⅠ活性在RA中是受损的，而关节液DNaseⅠ活性比血清低。血清DNaseⅠ活性与炎症指标ESR和CRP及中性粒细胞计数呈负相关。可见DNaseⅠ活性不足是NETs调控异常的一个重要因素，而关节液中异常增高的NETs标记物（cfDNA）提示关节炎症中大量形成的NETs不能被DNaseⅠ降解可能是重要的自身抗原来源。

虽然中性粒细胞在凋亡和其他炎症细胞在NETosis相关的过程中可能释放它们的染色质，但关节液cfDNA可能更多来源于NETosis。因为在早期RA患者关节液中中性粒细胞凋亡水平是显著减少的^[10] ，且只有极少量嗜酸性细胞和肥大细胞存在于RA患者关节液中^[11] 。我们的研究发现RA关节液cfDNA水平是升高的，而关节液DNaseⅠ活性是显著降低的，说明RA关节中NETs形成是增强的，DNaseⅠ活性降低使NETs过度形成和持续存在。推测NETs在RA中的致病作用是由于DNase Ⅰ活性降低或缺陷不能及时降解NETosis 过程中形成的染色体DNA网状物，使瓜氨酸化自身抗原暴露，机体对自身抗原丧失免疫耐受导致特异性自身抗体形成和炎症反应，该炎症坏境反过来又高度有利于NETosis的产生，造成一个恶性循环。

本研究显示RA关节液cfDNA水平与疾病活动度无相关性，这可能与疾病处于不同时期、药物干预等因素有关。但在炎症性关节炎关节液中均存在不同程度cfDNA 水平且与ESR 和CRP 呈显著正相关。说明NETs在这些疾病关节液中都有形成，而瓜氨酸化蛋白不仅存在于RA患者关节液中，在其他炎症性关节炎关节液中也存在^[12] ，因此蛋白瓜氨酸化可能是一种炎症相关的表现。此外在痛风性关节炎患者中关节液cfDNA水平是显著升高的，其是所有炎症性关节炎中发病急、炎症程度最强的，在急性期单钠尿酸盐结晶沉积在关节液和滑膜，可使大量中性粒细胞聚集并活化导致NETs聚合物形成^[13-14] 。

DNaseⅠ对中性粒细胞NETs形成具有负向调节作用，其是浓度依赖型的^[15] ，此外NETs还能通过巨噬细胞的吞噬作用被清除，该调节机制是表型和时间依赖型的。M1型巨噬细胞在与NETosis相互作用下能增加其自身cfDNA的释放，但最后能被其完全降解^[16] 。巨噬细胞功能紊乱是否参与RA的发病机制还未知，但RA关节液cfDNA水平与巨噬细胞数量无关而与中性粒细胞计数显著相关^[17] ，说明关节液NETs增强可能主要以DNaseⅠ活性受损为主。表达DNaseⅠ的病原微生物能抑制后期中性粒细胞活性氧簇（reactive oxygenspecies,ROS）的产生，进而逃离NETs捕杀^[18] 。RA中性粒细胞NETosis依赖ROS的产生，DNaseⅠ在RA中的作用在某方面上可能是通过抑制ROS 的产生减少NETs形成及促进已形成NETs降解。

总之，蛋白瓜氨酸化参与RA的发病，NETs是瓜氨酸化蛋白的来源之一，而DNase I 活性不足可能导致NETs来源的瓜氨酸化蛋白暴露，引起异常免疫应答和炎症的发生。也许外源性给予DNaseⅠ或抑制诱导NETosis的信号转导级联中的成分能为RA的治疗提供新的思路和靶点。