近50年来男性精子质量呈现逐渐下降趋势^[1]，人群流行病学调查和大量的动物实验发现城市大气环境污染是影响男性生殖健康的重要原因，而交通性污染是城市大气环境污染的首要污染源。机动车尾气中的主要污染物如颗粒物^[2]、B[a]P^[3]、内分泌干扰物^[4]等均对生殖系统有明确的毒性作用，噪声振动联合作用对胚胎发育有影响^[5]。有研究表明^[6-7]，环境污染物能够促进生殖系细胞表观遗传标志（DNA甲基化）发生改变，这些改变与男性不育症，男性弱精症等相关且多代遗传。国内外研究发现交通性污染物对雄性生殖系统有明确直接作用，但孕期母鼠暴露对其子代的影响还未见相关报道。本实验通过建立孕鼠交通性污染物暴露模型，应用高通量的甲基化测序技术（reduced representationbisulfite sequencing,RRBS）研究交通性污染物对子代雄性小鼠睾丸细胞DNA甲基化水平的影响。探讨孕期母鼠暴露对其雄性子代生殖系统的影响及可能机制，为交通性污染物对男性生殖健康危害的可能机制提供理论依据。

选择清洁级C57BL/6J 种系性成熟小鼠，体质量20~25 g，由重庆医科大学动物实验中心提供。适应性喂养（温度20~25 ℃、湿度45%~55%、自由饮食和进水）一周后，按1∶2（雄性∶雌性）于晚上9∶00合笼，次日早晨8∶00查雌鼠阴栓，查到阴栓者定为受孕第0天（d0），次日记为孕1 d（d1），以此推算孕龄。

选取重庆市主城区某交通枢纽的隧道作为染毒地点。将20只孕鼠随机分为暴露组和对照组，每组10只。将暴露组孕鼠放于染毒地点进行染毒，每天染毒8 h（9∶00~17∶00），从d4染毒至d14，共染毒10 d。其余时间及对照组都分笼饲养于重庆医科大学动物实验中心普通级，温度（21±1）℃，相对湿度40%~60%，自由进食和饮水。d18后将孕鼠单笼喂养直至其自然分娩。子代出生后正常饲养至性成熟（55日龄）。

分别在孕鼠染毒的d4、d8、d12、d14 进行采样。TSP、PM₁₀、PM_2.5：美国LIGHTHOUSE 尘埃粒子计数器。SO₂：盐酸付玫瑰品红比色法。NOx：盐酸萘乙二胺比色法。噪声：日本理音RION NL-42噪声分析仪。同时记录环境温度、湿度、气流、辐射等气象条件，并使用统一表格详细记录采样过程。

将暴露组和对照组子代雄鼠喂养至性成熟后用乙醚麻醉法处死小鼠，立即摘取双侧睾丸和附睾，剔除脂肪组织并用滤纸吸去组织表面的水份，称重并记录睾丸和附睾组织质量，计算脏器系数：脏器系数=脏器质量（g）/体质量（g）×100%。

暴露组和对照组各3只雄鼠各取0.05 g睾丸组织放入研钵中磨碎，加DNA提取液10 mL（含10 mL/LTris-cl pH 8.0，0.1 mol/L EDTA，Ph 8.0，0.5 g/L SDS），蛋白酶K消化，55 ℃水浴过夜，饱和酚/氯仿抽取DNA，冰乙醇沉淀DNA，常温晾干，加水溶解，紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度。

提取出来的DNA用于HiSeq 2500双端2×100 bpc测序模式检测。步骤如下：DNA质量检测合格的样品用于文库构建；使用限制性内切酶MspI 对大片段DNA 样品进行酶切处理，富集CpG 区域；对酶切后的DNA 片段进行末端修复，在3'端加上碱基“A”；用电泳法选择大小适宜的DNA片段进行回收，并用亚硫酸盐处理回收的片段；去盐处理后，PCR 扩增两端带有接头的DNA片段，构建测序文库；最后用质量合格的文库进行cluster制备和测序。

用Trizol 提取对照组和暴露组睾丸组织总RNA，核酸蛋白仪测定总RNA 的浓度及纯度。分别取总RNA2 mg，按反转录试剂盒说明书操作，逆转录反应合成cDNA。以反应所得cDNA在MyiQ实时定量PCR仪上进行PCR反应，每个基因各做3个平行组。分别绘制目的基因和内参照基因β-actin 的溶解曲线和标准曲线，检测各基因的反应特异性和扩增效率。以IQ5.0软件对PCR数据进行统计学分析，以各组目的基因表达水平与内参的比值为该基因的校正表达水平。引物序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 Real-time PCR引物序列 Table 1 Real-time PCR primer sequence Gene Primer Sequence Aldh7a1 F: 5'-ATAGCCCAGGTTTTGGAGGA-3' R: 5'-CCAGTGAAGGACAGCAGGTT-3' Rpe F: 5'-TTGCCATCAAACCAGGAACT-3' R: 5'-CCTCAACCAGTGAACCTTGG-3' β-actin F: 5'-ACCAACTGGGACGATATGGAGAAGA-3' R: 5'-ACGACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'

表 1 Real-time PCR引物序列 Table 1 Real-time PCR primer sequence

采用SPSS16.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

交通要道的TSP、PM₁₀、PM_2.5浓度均高于动物实验中心，差异具有统计学意义（P＜0.05），其浓度分别为国家环境空气质量标准（GB 3095-2012）一级标准浓度限值的5.08倍，4.12倍，4.02倍。交通要道的NOx浓度和噪声远高于动物实验中心，差异有统计学意义（P＜0.05），而SO₂浓度在两个测定点的差异没有显著性（P＜0.05，表 2）。

表 2(Table 2)

表 2 交通性污染物测定结果 Table 2 Determination of the major pollutants in the vehicle exhaust collected from the traffic environment (Mean±SD, n=4) Site SO2 (mg/m3) NOx (mg/m3) TSP (mg/m3) PM2.5 (mg/m3) PM10 (mg/m3) noise（dB） Animal experimental center 0.006±0.0008 0.006±0.0015 0.056±0.023 27±5.33 45±2.27 19.16±1.95 Artery traffic 0.008±0.0023 0.079±0.147* 0.61±0.049* 141±23.45* 206±20.78* 77.60±7.05* *P＜0.05 compared with animal experiment center.

表 2 交通性污染物测定结果 Table 2 Determination of the major pollutants in the vehicle exhaust collected from the traffic environment (Mean±SD, n=4)

子代雄鼠性成熟后，暴露组与对照组小鼠的体质量、睾丸脏器系数、附睾脏器系数差异无统计学意义（P＜0.05，表 3）。

表 3(Table 3)

表 3 交通性污染物对子代雄鼠体质量、睾丸和附睾的影响 Table 3 Effect of vehicle exhaust on weight, testis and epididymisin in the male offspring mice (Mean±SD, n=20) Group Body weight (g) Weight coefficient of testis (%) Weight coefficient of epididymis (%) Control group 27.00±1.911 0.696±0.32 0.167±0.07 Exposed group 25.54±2.903 0.649±0.19 0.160±0.08

表 3 交通性污染物对子代雄鼠体质量、睾丸和附睾的影响 Table 3 Effect of vehicle exhaust on weight, testis and epididymisin in the male offspring mice (Mean±SD, n=20)

胞嘧啶发生甲基化数目最多的区域为基因间区段和内含子，暴露组甲基化胞嘧啶为对照组的两倍。胞嘧啶发生甲基化最少的区域为基因下游和结合部位（图 1）。与对照组比较，暴露组子代雄鼠睾丸细胞基因组有23个基因甲基化水平提高，35个基因甲基化水平降低（P＜0.05）。甲基化水平差异的基因的分布位于绝大多数染色体上，最多的是chr5（8个基因），而染色体chr3、chr13、chr18、chr20、chr21、chr22、X、Y未有基因发生甲基化改变（图 2）。将上述58 个基因进行GO类型分析，并分类汇总，进行富集度检验，发现暴露组中发生甲基化的基因几乎涉及所有主要生精过程，如糖酵解途径、丙酮酸代谢过程、精子活力、细胞凋亡、胚胎发育、细胞蛋白质分解代谢过程、ATP结合等（表 4）。

图 1(Figure 1)

图 1 对照组和暴露组基因功能区的甲基化情况 Figure 1 Methylation in the functional regions of the genes in the control and exposure group.

图 2(Figure 2)

图 2 58个甲基化基因的染色体分布 Figure 2 Chromosome distribution of 58 methylated genes.

表 4(Table 4)

表 4 RRBS测序结果中暴露组发生甲基化的58个基因GO类型分析T Table 4 GO analysis of 58 methylated genes in the in the control and exposure groups after RRBS sequencing Biological process GO ID % Chang P Genes Glycolysis process 0006096 37.93 9.61E-04 Aldh7a1, Adh5, Rpia, PGM2, GPI, etc Pyruvate metabolism process 0006090 25.86 0.04 Rpe, PDHB, KorA, DLAT, etc Sperm motility 0030317 17.24 0.03 Rab12, APOB, SEMG2, SEMG2, etc Apoptosis 0060785 6.89 0.05 BCL2A1A, GRAMD4, EPHA2, TRAF4 Embryonic morphogenesis 0048598 6.89 0.05 2610005L07RIK, HOXD3, EPHA2, CDH23 Cellular protein catabolic process 0044257 4.34 0.29 FBXL19, SOCS5, FBXL17, FBXO46, CNOT4 ATP binding 0005524 1.13 0.05 HELQ, FLT1, CDK8, KIF19A

表 4 RRBS测序结果中暴露组发生甲基化的58个基因GO类型分析T Table 4 GO analysis of 58 methylated genes in the in the control and exposure groups after RRBS sequencing

根据甲基化富集度检验的P值、甲基化差异基因的显著性通路等指标，将两个代表性基因Aldh7a1，Rpe挑选出来进行验证（表 5）。qRT-PCR 检测结果显示（图 3），与对照组相比，暴露组子代雄鼠睾丸细胞中Aldh7a1，Rpe mRNA表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表 5(Table 5)

表 5 Aldh7a1，Rpe基因KEGG通路分析 Table 5 KEGG pathway analysis of Aldh7a1 and Rpe genes Gene Chromosome loction ID Pathway Aldh7a1 5 mmu00620 Pyruvate metabolism Rpe 10 mmu00030 Flycolytic pathway

表 5 Aldh7a1，Rpe基因KEGG通路分析 Table 5 KEGG pathway analysis of Aldh7a1 and Rpe genes

图 3(Figure 3)

图 3 对照组和暴露组Aldh7a1，Rpe基因mRNA相对表达量 Figure 3 Aldh7a1 and Rpe mRNA expressions in the control and exposure groups. *P＜0.05 compared with control group.

城市大气污染导致的生殖健康损害是目前人类面临的一个严峻问题^[8]。近年来，随着我国经济发展和城市化进程的加快，机动车保有量快速增加，机动车尾气已成为空气污染的重要来源之一^[9]，是造成灰霾、光化学烟雾污染^[10]的重要原因。本研究调查结果显示，重庆市主城区某交通要道的颗粒物浓度为国家环境空气质量标准（GB 3095-2012）一级标准的4~5倍，NOx与噪声虽未超过该标准，但明显高于对照组，提示交通要道污染情况十分严重。

本实验通过建立孕鼠交通性污染物暴露模型，发现暴露组子代雄鼠体质量和生殖系统脏器系数并无统计学改变，表明器官未发生萎缩、充血、水肿、增生肥大等变化^[11]。许多研究结果证实了器官萎缩的细胞凋亡假设，当细胞凋亡与增殖之间失衡，可能导致器官实质细胞数量减少发生萎缩^[12]；机体发生慢性充血可能因致炎因子作用、肿瘤压迫等所引起，常导致患部水肿引起实质细胞萎缩、结缔组织增生和肥大，从而使体重和脏器系数发生改变^[13]。本文差异甲基化基因GO富集分析结果中分类基因不直接参与调控萎缩、充血、水肿、增生肥大有关的生物学过程，如细胞凋亡、致炎因子、肿瘤发生。因此这可能是小鼠体质量和脏器系数没有改变的部分原因，但其器官功能是否发生了改变还需接下来进一步检测。暴露组在各基因功能区中胞嘧啶甲基化的数目都远高于对照组，提示孕鼠暴露于汽车尾气、噪声等环境因子中，引起子代雄鼠睾丸细胞DNA发生甲基化改变。由此可见，在胚胎发育的关键阶段，环境因子通常不引起DNA序列的改变，但是会引起生殖系细胞表观基因组（DNA甲基化）发生永久性改变，通过生殖系细胞多代传递，从而产生表观遗传表型^[14-15]。本研究发现，在基因不同功能区中，基因间区和内含子是胞嘧啶发生甲基化最多的区段，和李俊贤的研究结果一致^[16]。这两个区段皆是非编码区域，但其转录出的MicroRNA通过调控基因的开启、关闭时间和表达频率调控着精原干细胞的减数分裂和精子发生过程^{[17, 18]}。由此推测甲基化改变致MicroRNA表达水平改变而导致基因表达异常也可能损害男性生殖功能。

本研究发现子代雄性小鼠睾丸细胞基因组58个差异甲基化基因，对这些基因进行GO富集分析，发现这些基因几乎涉及所有主要精子发生过程，如：睾丸细胞的异常凋亡影响精子正常分化成熟和数量稳定^[19]，同时也使线粒体膜电位发生改变，影响三磷酸腺苷（ATP）异常代谢和供能，使精子活动力降低，进而导致男性弱精子症的产生^[20-21]。睾丸细胞中DNA甲基化异常对受精后胚胎发育有影响，如：妊娠率明显下降、胚胎着床前的损失率明显增加、小鼠发育迟缓^[22-23]等。GO富集分析发现富集程度最高的是糖酵解途径和丙酮酸代谢过程，筛选出与其有关的Aldh7a1和Rpe基因在暴露组表达下降。Rpe参与糖酵解途径调控，糖酵解途径产生的丙酮酸和乳酸在代谢过程中能产生ATP，为生精细胞的发生和发展过程提供能量^[14]。Aldh7a1与丙酮酸代谢过程有关，有研究表明，异常的丙酮酸代谢过程会促进细胞凋亡过程中生精细胞的变性^[24]。因此，我们推测甲基化所致的基因表达水平改变可能是交通性污染物对男性生殖系统损害的原因之一，然而其中涉及复杂调控网络的变化，具体机制仍待进一步研究。