人脐静脉内皮细胞（HUVECs）是血管形成实验的经典模型细胞。血管形成不仅在正常生理条件下发生，同时也会在肿瘤及其他许多非肿瘤疾病出现^[1-2]。因此，HUVECs作为工具细胞被广泛用于候选药物筛选^[3-5]、血管构建等^[6-7]实验研究。人脐静脉作为内皮细胞的主要来源具有取材容易、来源充足及操作简单等优点，而且从足月妊娠分娩的新生儿脐静脉收获的HUVECs活力强、纯度高，被广泛用于临床前基础研究。

细胞饥饿培养，即血清饥饿，通过降低培养液中的血清浓度或完全无血清培养，使细胞因缺乏血清中的生长因子而不能分裂，将细胞周期阻滞在G₀/G₁期。在此基础上进行的后续处理，如给予刺激因素或者药物时，可以避免细胞所处的状态不同或血清中因子的干扰造成的实验误差，增加实验结果的稳定性。但不同细胞用不同血清浓度处理不同时间的饥饿效果各不相同^[8]。

本实验采用酶灌注消化法成功分离了高纯度的HUVECs，并探讨不同血清浓度处理不同时间对HUVECs周期的影响，找到了HUVECs的最佳饥饿条件，为进一步的HUVECs实验提供实验基础。

足月妊娠分娩的新生儿脐带均由南方医科大学珠江医院妇产科提供。

Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）；内皮细胞专用培养基（Sciencell公司，美国）；兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体（Novus公司，美国）；山羊抗兔IgG Fc（Alexa Fluor488）（abcam公司，美国）；FITC标记鼠抗人CD31多克隆抗体（BD公司，美国）；FITC标记鼠IgG 1k抗体（BD公司，美国）。

（Hera cell 150, Heraeus）；超净工作台（JW-CJ-1F，苏州净化设备厂）；共聚焦显微镜（OLYMPUS公司，日本）；FACSVantageSE流式细胞仪（BD公司，美国）。

将脐带（15~20 cm）放入无菌生理盐水中，置4℃冰箱保存，3 h内进行分离。用含1%双抗的无菌生理盐水洗净脐带表面残血，剪去有血肿部分，两端修齐备用。找到脐静脉（壁薄、管腔大），插入5 mL注射器针头（针减半修钝），用止血钳固定。用含1%双抗的无菌生理盐水反复冲洗脐静脉至流出液清亮。将预热的0.1%Ⅱ型胶原酶注入脐静脉，待下端有胶原酶液流出后用止血钳夹住。继续注入适量胶原酶液使管腔充盈，保持注射器竖直固定（此时注射器内应有胶原酶以维持压力），将脐带置于含少量预热生理盐水玻璃皿中，两端微抬成U型，放入37℃恒温箱消化15 min。消化结束后打开下端止血钳，使消化液流入预先装有预热内皮细胞专用培养基（含5% FBS、1% ECGS、1%双抗）的15 mL离心管中，再用培养基冲洗静脉管两次，收集冲洗液，1200 r/min离心5 min，弃上清，用内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。24 h后换液，之后每隔24 h半量换液1次。待细胞生长的融合度达到80%~90%时，用0.25%胰酶消化传代。

换液后在显微镜下观察细胞形态及生长特征，采用细胞免疫荧光方法染色鉴定。胰酶消化细胞后，接种于35 mm培养皿内，待细胞密度达到约80%后用于鉴定；细胞用PBS漂洗1次；加入4%多聚甲醛500μL，37℃固定15 min，PBS漂洗5 min×3次；加入500μL的0.5% Triton X-100室温破膜10 min，PBS漂洗5 min×3次；加入500μL的10%山羊血清（1% BSA/PBS配制）37℃封闭30 min；倾去封闭液。按1:80稀释比例加入特异性兔抗人anti-VⅢ抗体500μL，37℃孵育3 h，PBS漂洗5 min×3次；阴性对照组用PBS代替一抗；按1:200稀释比例加入Alexa Fluor 488标记山羊抗兔二抗500μL，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次；加入DAPI染核液，室温孵育15 min，弃去染色液，甲醇漂洗1次；加入适量体积封片剂（甘油：PBS=6:4）封片；共聚焦显微镜观察、拍照。

采用流式细胞术检测细胞纯度。取原代HUVECs置于两个流式管中，每管2×10⁶个细胞，分别加入FITC标记鼠抗人CD31多克隆抗体及同型对照IgG，室温避光30 min孵育。PBS洗涤细胞，离心5 min，重复2次，200μL PBS重悬，上机检测。

取8代内对数生长期HUVECs接种于六孔板，待细胞融合度为60%~80%时，用PBS洗涤细胞3次，分别用0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的内皮细胞专用培养基培养0、6、12、18和24 h。处理结束，消化细胞，洗涤收集，并固定于75%预冷乙醇中。将固定过夜的细胞洗涤离心后加RNA酶37℃30 min，加PI染料避光染色30 min，上机检测。每个处理独立重复实验3次。

倒置显微镜下，细胞呈扁平不规则多边形，边缘清楚，培养瓶周边细胞多为长梭形生长。细胞生长时彼此紧密相连，呈典型的铺卵石状排列，细胞较密处呈涡旋状排列。Ⅷ因子相关抗原细胞免疫荧光观察，可见细胞呈圆形、梭形、多边形，细胞核被DAPI染为蓝色（图 1A），目的蛋白Ⅷ因子可见于质核内呈绿色（图 1B、C），证实培养的细胞为人脐静脉内皮细胞。流式结果显示，99.67%的原代细胞CD31表面抗原呈阳性表达（图 2）。

图 1(Figure 1)

图 1 HUVECs免疫细胞化学染色观察 Figure 1 Immunocytochemical staining of HUVECs (Original magnification:×400). A: Cell nuclei are counterstained with DAPI (blue); B: Positive staining for factorⅧ(green); C: FactorⅧseen in the cytoplasm and cell nuclei.

图 2(Figure 2)

图 2 流式细胞术检测HUVECs CD31表面抗原表达 Figure 2 Expression of CD31 in HUVECs analyzed by flow cytometry.

流式细胞术结果显示，血清浓度为0%、0.1%、0.5%、1%时，处理相同的时间，G₀/G₁期细胞含量无明显差别（图 3）。饥饿0 h，即正常血清浓度（5%）培养的细胞，G₀/G₁期细胞含量约在60%以下；饥饿6 h，可以获得70%左右的G₀/G₁期细胞；饥饿时间为12 h，可获得80%~90%的G₀/G₁期细胞；饥饿时间为18、24 h，可获得95%左右的G₀/G₁期细胞。统计分析结果显示，饥饿时间相同时，不同血清浓度（0%、0.1%、0.5%、1%）处理间无统计差异（P=0.220）。

图 3(Figure 3)

图 3 不同的血清浓度和饥饿时间对HUVECs G0/G1期的影响 Figure 3 Effects of different serum concentrations and durations of serum starvation on G0/G1 cell percentages in HUVECs.

流式细胞术结果显示，血清浓度相同时，饥饿不同的时间，G₀/G₁期细胞含量不同（图 3）。用完全无血清培养基培养不同时间的G₀/G₁期细胞含量进行两两比较，结果见图 4。培养0 h与6 h的G₀/G₁期细胞含量明显差别；培养12、18与24 h的G₀/G₁期细胞含量无明显差别；而培养12 h（或18 h或24 h）的G₀/G₁期细胞含量明显高于培养0 h（或6 h）的G₀/G₁期细胞含量。

图 4(Figure 4)

图 4 无血清培养不同时间对HUVECs G0/G1期的影响 Figure 4 Effects of different durations of serum-free cultivation on G0/G1 phase cells in HUVECs. *P < 0.05, #P < 0.01 vs 0 h group.

近年来，原代人脐静脉内皮细胞分离培养多采用胰酶消化法。学者们发现，相比于机械刮取法和组织块移植法，采用胰酶灌注消化从新生儿脐静脉获得的内皮细胞纯度高、增殖能力强。而且胰酶灌注消化步骤简单，可总结为“插管固定，洗外洗内，胰酶消化，收集培养”。在操作过程中，稍有困难的地方在于插管的选择。有学者自制空针软管成功收获了纯度极高的HUVECs ^[9]，但我们发现由于软管较粗，插入比较困难，容易滑出，用止血钳固定过紧会造成夹闭。而且采用软管灌注，胶原酶容易从插口溢出，达不到管腔充盈的效果。文献报道也有用针头插入，但针头极易划破静脉内壁，导致细胞不纯。因此本实验将针头剪半、磨钝，再用止血钳固定，可以轻松顺利的灌注胶原酶充盈脐静脉。

文献报道，诸如考察外因对细胞运动、基因或蛋白影响的实验^[10-11]要求获得同步生长的细胞群。而目前已有多种方法可以实现^[12-14]，血清饥饿法是其中最简单有效的方式。血清饥饿对细胞本身的干扰极小，并可在短时间内收获大量的G₀/G₁期的细胞，而且对细胞进行饥饿处理可以清除血清中可能存在的影响因子，保证了外因的作用效果。由于不同细胞的血清饥饿条件不同，在摸索细胞饥饿条件时，需要综合考虑血清浓度和饥饿时间对细胞的影响。在筛选到合适的血清浓度后，饥饿时间过短，会有一定量的细胞未处于G₀/G₁期，而发生漏渗，漏出的细胞会进入S期甚至G₂-M期^[15]；而饥饿时间过长又会使细胞因其DNA大量降解而死亡^[16]。本实验用内皮细胞专用培养基培养原代HUVECs时，正常条件的血清浓度为5%。血清饥饿时，可以考虑0%~1%的血清浓度，实验分别用0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度培养HUVECs相同的时间，发现这4种血清浓度对细胞周期的影响并无统计学差异。因此无血清条件可当作HUVECs的最佳血清饥饿浓度。在考察血清饥饿时间时，发现0%、0.1%、0.5%和1%浓度的血清饥饿HUVECs 18 h以上会出现大量细胞死亡，综合流式细胞术检测细胞周期结果的统计分析考虑，认为完全无血清培养原代HUVECs 12 h即可获得高纯度的G₀/G₁期细胞，为后续实验研究提供了可靠的实验基础。