2016, Vol. 36
2. 贵州省遵义市第一人民医院检验科, 贵州 遵义 563002 ;
3. 贵州省人民医院肾内科, 贵州 贵阳 550000 ;
4. 贵州省人民医院骨科, 贵州 贵阳 550000 ;
5. 贵州大学药学院，贵州 贵阳 550000 ;
6. 贵州医科大学研究生院，贵州 贵阳 550000
2. Clinical Laboratory, Zunyi First People's Hospital, Zunyi 563002, China ;
3. Department of Nephrology, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang 550000, China ;
4. Department of Orthopedics, Guizhou Provincial People's Hospital, Guiyang 550000, China ;
5. College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550000, China ;
6. Graduate School of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China
系统性红斑狼疮（SLE）是一种以血浆中存在多种自身抗体，累及全身多系统与器官的慢性自身免疫性疾病。SLE患者体内过度活化的自身反应性T、B淋巴细胞产生大量自身抗体以及炎性细胞因子，例如抗双链DNA抗体、白细胞介素等[1]。免疫复合物沉积等多因素致使受累器官损伤，从而产生各种临床表现，如肾炎、心血管疾病、关节炎、皮肤炎症、中枢神经系统受累等多种症状[2-4]。B淋巴细胞作为SLE特异性抗核抗体，尤其是抗双链DNA抗体的细胞来源，在SLE的发病机制中起着非常重要的作用[3]。
间充质干细胞（MSCs）是一类主要来源于骨髓的细胞群，表达中等水平的主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类分子，而不表达或仅表达低水平的MHC-Ⅱ类分子[5]。MSCs除了具备多项分化潜能，其免疫调节能力也得到大量试验证实，例如MSCs可以抑制树突状细胞的分化与成熟，抑制B细胞增殖与抗体分泌等[6-7]。
我们过去的研究表明，SLE患者骨髓来源的MSCs存在形态、增殖能力等多方面异常[8]，这些异常的SLE来源的MSCs对B淋巴细胞的抑制作用较弱[9]。SLE小鼠模型与SLE患者临床前研究都显示，正常骨髓来源的MSCs对SLE有改善作用，能缓解狼疮肾炎，以及血清学异常等症状[10-11]。而Youd等[12]发现，MSCs可促进B细胞分化成熟为浆细胞并延长其存活时间，促进自身抗体的产生以及免疫复合物沉积，对（NZB X NZW）F1小鼠发生SLE不能起到保护作用。2015年，Thiel的团队报道，MSC能保护（NZB X NZW）F1狼疮小鼠模型的肾脏功能并延长寿命[10]。基于这些矛盾的结果，本研究猜想，MSCs所处的微环境，能干预其免疫调节功能，导致研究人员得到矛盾的结果。活动期SLE患者体内大量存在的自身抗体、炎性细胞因子等，或能影响MSC对其它免疫细胞的抑制作用。本研究以活动期SLE患者富集血浆，代替胎牛血清，混合培养MSCs与B细胞，检测MSCs对B细胞的免疫调节作用。
1 资料和方法 1.1 临床资料25例SLE患者（22例女性，3例男性，年龄23~61岁），来自贵州省人民医院肾内科，贵州医科大学附属医院肾内科及贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科，满足1982年美国风湿病协会（ACR）修订的SLE诊断分类标准。采用SLE疾病活动指数（SLEDAI）[13]评价患者的疾病活动情况。6名骨髓捐献者来自香港大学玛丽医院骨髓移植中心。
1.2 实验分组实验分为B淋巴细胞组（B）、B淋巴细胞+脂多糖组（B+LPS）、B淋巴细胞+脂多糖+MSCs组（B+LPS+MSCs）。B淋巴细胞组：将B淋巴细胞按1×105/孔培养于96孔板中，不加脂多糖刺激或MSCs；B淋巴细胞+脂多糖组：将B淋巴细胞按1×105/孔培养于96孔板中，同时加入脂多糖刺激B淋巴细胞增殖；B淋巴细胞+脂多糖+MSCs组：先将MSCs按1×105/孔培养于96孔板中培养4 h，待MSCs贴壁后，加入1×105B淋巴细胞，同时加入脂多糖。
本实验设置两个培养系统，其一加入胎牛血清（FBS），培养于FBS培养基中的试验组，分别命名为FB、FB+LPS、FB+LPS+MSCs。另一个培养系统为活动期SLE患者（SLEDAI>6）富集血浆。培养于SLE患者富集血浆培养基中的试验组，命名为SB、SB+LPS、SB+LPS+MSCs。
1.3 方法 1.3.1 骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外培养与扩增肝素抗凝抽取10 mL骨髓，经Ficoll离心30 min，获得单个核细胞（PBMCs），用PBS 1500 r/min，离心5 min，洗3次后，培养于75 cm2的细胞培养瓶中。培养基含MEM-α，20%胎牛血清，100 U/mL青霉素与100μg/mL链霉素。4~5 d后换液，去除非黏附细胞。当细胞达到90%融合后，传代到新的培养瓶中，继续培养达到90%融合即可收获，冻存于液氮罐中备后期试验使用。培养所获MSCs经流式细胞仪检测，不表达CD34、CD45和CD14，表达MSCs标志物CD73、CD90、CD105。分化诱导试验显示，所获MSCs均可成功诱导为成骨细胞以及脂肪细胞。
1.3.2 B淋巴细胞分选采用B淋巴细胞分离试剂盒，从外周血单个核细胞中阴性选择分离得到B淋巴细胞。每2×107个PBMCs加入20µL生物素标记的抗体混合液和80µL缓冲液，4~8℃孵育10 min。加入60µL缓冲液与40µL抗-生物素磁珠，4~8℃孵育15 min。细胞经缓冲液洗涤后，加入500µL缓冲液，采用MS磁珠分选柱进行分选，流出的细胞即为B淋巴细胞。
1.3.3 MSCs与B淋巴细胞混合培养将B淋巴细胞按上述分组培养于96孔板中，培养液为RPMI 1640加10%胎牛血清或富集的SLE患者血浆，2 mmol/L谷氨酰胺，10 mg/L非必需氨基酸，1 mmol/L丙酮酸盐，100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素。加入脂多糖刺激时，其终浓度为2.5µg/mL。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞表型培养获得的MSCs用藻红蛋白（PE）/藻红蛋白一花青苷5（PE-Cy5）标记的抗-CD14、CD29、CD34、CD38，CD45、CD73，异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗-CD44、CD90、CD105、CD106进行染色。MSCs与B淋巴细胞混合培养后，收取悬浮的B淋巴细胞，采用PE-CD19、PE-Cy5-CD27以及FITC-CD38染色。细胞经抗体染色后，用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达，采用FlowJo分析试验数据。1.3.5细胞增殖能力检测本试验将纯化的B淋巴细胞按1:1比例与MSCs共培养于96孔板，经脂多糖刺激72 h后，加入0.5µCi 3H标记的胸腺嘧啶，继续培养16 h。细胞收集于玻璃纤维滤膜上，37℃温箱烘干后用液闪仪进行检测分析。
1.4 统计学分析数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 12.0软件进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 正常MSCs可抑制SLE B淋巴细胞增殖在FBS培养条件下，细胞增殖实验结果显示，脂多能刺激SLE患者来源的B细胞增殖，B细胞+脂多糖组与B细胞组的差异有统计学意义（FB：161±77；FB+LPS：945±328；P < 0.05）。
加入MSCs干预后，脂多糖刺激的SLE患者来源的B淋巴细胞的增殖能被MSCs抑制（FB+LPS：945±328；FB+LPS+MSCs：204±91；抑制率为78.4%），两组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.2 SLE患者富集血浆抑制正常MSCs的免疫调节作用采用SLE患者富集血浆替代FBS，混合培养MSCs与SLE B淋巴细胞，增殖试验发现，脂多糖可刺激SLE B淋巴细胞增殖，B淋巴细胞+脂多糖组与B淋巴细胞组比较，差异有统计学意义（SB：192±98；SB+LPS：979±352；P < 0.05）。
加入MSCs干预后，B淋巴细胞增殖受到抑制，B淋巴细胞+脂多糖+MSCs组与B淋巴细胞+脂多糖组比较，差异有统计学意义（SB+LPS：979±352；SB+LPS+MSCs：446±138；P < 0.05，抑制率为54.4%）。
SLE患者混合血浆对SLE患者来源的B淋巴细胞没有明显刺激作用（FB：161±77；SB：192±98；P>0.05），对脂多糖的B淋巴细胞增殖作用也没有明显影响（FB+LPS：945±328；SB+LPS：979±352；P>0.05）。然而，SLE患者混合血浆能明显抵制正常MSCs对SLE B淋巴细胞的增殖抑制作用（FB+LPS+MSCs：204±91；SB+LPS+MSCs：446±138；P < 0.05）。
2.3 正常MSCs可抑制SLE B淋巴细胞成熟不成熟的B淋巴细胞多表达CD19，记忆性B细胞表达CD27，浆细胞高表达CD38。本研究发现，在FBS培养基的培养条件下，脂多糖可刺激SLE患者来源B淋巴细胞成熟，高表达CD27与CD38，使记忆B细胞与浆细胞比例增多。正常MSC可抑制SLE患者来源的B淋巴细胞被脂多糖刺激高表达的CD27与CD38，对CD19的表达无明显影响（表 1）。
|
表 1 MSCs对SLE B淋巴细胞表达的CD19、CD27与CD38的影响 Table 1 Effects of MSCs on the expression of CD19, CD27 and CD38 on SLE B lymphocytes |
在SLE患者富集血浆培养条件下，SLE患者来源的B淋巴细胞高表达CD19，CD38。脂多糖刺激对CD19，CD27，CD38的表达无明显影响。加入正常MSCs后，CD19的表达受到抑制，而CD27与CD38的表达明显增高（表 2）。
|
|
表 2 SLE患者血浆培养条件下MSCs对SLE B淋巴细胞亚群的影响 Table 2 Effects of MSCs on SLE B lymphocyte subsets in the culture system with SLE plasma |
系统性红斑狼疮是一种以患者体内持续存在自身抗体为特征的慢性自身免疫性疾病，病因涉及遗传、感染、紫外线刺激等；具体发病机制尚不清楚，但B淋巴细胞存在异常活化对该疾病的发生发展所起的重要作用已得到大量证实[13-14]。SLE的治疗以激素和免疫抑制剂为主[15]，其严重的毒副作用影响了患者的生活质量。近年来，随着干细胞研究的发展，间充质干细胞移植成为临床许多疾病的辅助手段。虽然动物实验与临床前期试验证明间充质干细胞对SLE患者有一定疗效，但疗效不稳定，相反结果的研究亦见报道[10, 12]。由于SLE病情复杂，患者血浆中大量存在的自身抗体与炎症细胞因子，对于在此微环境中发生免疫调节功能的间充质干细胞可能存在一定的影响。为了证实此假设，本研究采用SLE患者富集血浆，替代胎牛血清，混合培养正常人骨髓来源的MSCs与SLE患者外周血来源的B淋巴细胞，检测MSCs对B淋巴细胞增殖与成熟的影响。研究结果发现，在SLE患者富集血浆培养条件下，MSCs对SLE B淋巴细胞的增殖也能起到抑制作用，但与FBS培养条件相比，此抑制功能明显下调，抑制率从78.4%降至54.4%。
在FBS培养条件下，正常MSCs亦能抑制脂多糖刺激的SLE患者来源的B淋巴细胞成熟，下调CD27与CD38的表达，说明MSCs能抑制B淋巴细胞成熟为浆细胞。这一抑制作用，将使大多数B淋巴细胞处于幼稚或静息状态，不会产生大量的抗体。采用SLE患者富集血浆培养，SLE B淋巴细胞在无脂多糖刺激的条件下，CD38表达量高于FBS培养条件下的表达。说明SLE患者富集血浆对B淋巴细胞存在一个基础的刺激作用，促使B细胞成熟为具有抗体分泌能力的浆细胞。加入MSCs干预后，B淋巴细胞表面表达的CD19下降，而CD27与CD38则进一步升高。此现象提示，在活动期SLE患者富集血浆培养条件下，MSCs对B淋巴细胞的成熟抑制功能受到负向调控，B淋巴细胞有进一步成熟的趋势。
以上结果揭示，在活动期SLE患者富集血浆存在的微环境中，正常MSCs对B淋巴细胞增殖与成熟的免疫调节作用均受到抑制。
有报道表明，补充CCL2能改善SLE骨髓来源的异常MSCs对B淋巴细胞的抑制作用[9]。提示在SLE外周血微环境中，大量存在的自身抗体与细胞因子是影响间充质干细胞发挥免疫抑制作用的一个影响因素，也可能是SLE患者自身细胞异常，需补充相应细胞因子改善其功能。且由于活动期与静息期SLE患者外周血中存在的差异也较大，导致MSCs移植对每个患者产生的疗效迥异。总之，MSCs的免疫抑制作用受体内微环境影响的机制有待进一步探索。
1989年，Toyama等[16]报道了第1例应用血浆置换术治疗孕期SLE患者，提示血浆置换对SLE有积极的辅助治疗作用。然而采用该方法与其它手段联合治疗SLE的案例仍然匮乏[17]。直至2011年，Liu等[18-19]报道其团队应用双膜过滤血浆置换术成功救治1例SLE合并自身免疫性甲状腺疾病的患者，分别于2012、2015年，采用双膜过滤血浆置换术联合治疗SLE的案例又见报道。这些成功案例提示，采用双膜过滤血浆置换术，改善SLE患者外周血微环境，联合应用MSCs移植，或有望提高MSCs对SLE的疗效。
| [1] |
Mirabelli G, Cannarile F, Bruni C, et al. One year in review 2015: systemic lupus erythematosus[J].
Clin Exp Rheumatol,2015, 33 (3) : 414-25.
( 0)
|
| [2] |
Ball SG, Shuttleworth CA, Kielty CM. Platelet-derived growth factor receptor-alpha is a key determinant of smooth muscle alpha-actin filaments in bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].
Int J Biochem Cell Biol,2007, 39 (2) : 379-91.
DOI: 10.1016/j.biocel.2006.09.005. (0)
|
| [3] |
Zhao L, Ye Y, Zhang X. B cells biology in systemic lupus erythematosus-from bench to bedside[J].
Sci China Life Sci,2015, 58 (11) : 1111-25.
DOI: 10.1007/s11427-015-4953-x. (0)
|
| [4] |
Henriques A, Silva I, Inês L, et al. CD38, CD81 and BAFFR combined expression by transitional B cells distinguishes active from inactive systemic lupus erythematosus[J].
Clin Exp Med,2016, 16 (2) : 227-32.
DOI: 10.1007/s10238-015-0348-3. (0)
|
| [5] |
Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues[J].
Science,1997, 276 (539) : 71-4.
(0)
|
| [6] |
Spaggiari GM, Abdelrazik H, Becchetti F, et al. MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function by selectively interfering with the generation of immature DCs: central role of MSC-derived prostaglandin E2[J].
Blood,2009, 113 (26) : 6576-83.
DOI: 10.1182/blood-2009-02-203943. (0)
|
| [7] |
Liang J, Sun L. Mesenchymal stem cells transplantation for systemic lupus erythematosus[J].
Int J Rheum Dis,2015, 18 (2) : 164-71.
DOI: 10.1111/apl.2015.18.issue-2. (0)
|
| [8] |
Nie Y, Lau CS, Lie AK, et al. Defective phenotype of mesenchymal stem cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].
Lupus,2010, 19 (7) : 850-9.
DOI: 10.1177/0961203310361482. (0)
|
| [9] |
Chang LS, Leng CH, Yeh YC, et al. Toll-like receptor 9 agonist enhances anti-tumor immunity and inhibits tumor-associated immunosuppressive cells numbers in a mouse cervical cancer model following recombinant lipoprotein therapy[J].
Mol Cancer,2014, 13 (13) : 60.
(0)
|
| [10] |
Thiel A, Yavanian G, Nastke MD, et al. Human embryonic stem cell-derived mesenchymal cells preserve kidney function and extend lifespan in NZB/W F1 mouse model of lupus nephritis[J].
Sci Rep,2015, 5 (5) : 17685.
(0)
|
| [11] |
Liu RH, Li YQ, Zhou WJ, et al. Supplementing mesenchymal stem cells improves the therapeutic effect of hematopoietic stem cell transplantation in the treatment of murine systemic lupus erythematosus[J].
Transplant Proc,2014, 46 (5) : 1621-7.
DOI: 10.1016/j.transproceed.2014.03.003. (0)
|
| [12] |
Youd M, Blickarz C, Woodworth L, et al. Allogeneic mesenchymal stem cells do not protect NZB x NZW F-1 mice from developing lupus disease[J].
Clin Exp Immunol,2010, 161 (1) : 176-86.
(0)
|
| [13] |
Schned ES, Glickstein SL, Doyle MA. Derivation of the SLEDAI[J].
Arthritis Rheum,1993, 36 (6) : 877-8.
(0)
|
| [14] |
Groom J, Mackay F. B cells flying solo[J].
Immunol Cell Biol,2008, 86 (1) : 40-6.
DOI: 10.1038/sj.icb.7100142. (0)
|
| [15] |
Goldblatt F, Isenberg DA. New therapies for systemic lupus erythematosus[J].
Clin Exp Immunol,2005, 140 (2) : 205-12.
DOI: 10.1111/cei.2005.140.issue-2. (0)
|
| [16] |
Toyama M, Oozono S, Uruta Y, et al. Effective treatment with double filtration plasmapheresis (DFPP) and high dose intravenous gammaglobulin therapy in a pregnant patient with systemic lupus erythematosus[J].
Nihon Naika Gakkai Zasshi,1989, 78 (11) : 1601-2.
DOI: 10.2169/naika.78.1601. (0)
|
| [17] |
Aoki A, Hagiwara E, Ohno S, et al. Case report of systemic lupus erythematosus patient with hemophagocytic syndrome, treated with plasma exchange, with specific reference to clinical profile and serum cytokine levels[J].
Ryumachi,2001, 41 (6) : 945-50.
(0)
|
| [18] |
Liu LL, Li XL, Wang LN, et al. Successful treatment of patients with systemic lupus erythematosus complicated with autoimmune thyroid disease using double-filtration plasmapheresis: a retrospective study[J].
J Clin Apher,2011, 26 (4) : 174-80.
DOI: 10.1002/jca.v26.4. (0)
|
| [19] |
Li M, Wang Y, Qiu Q, et al. Therapeutic effect of double-filtration plasmapheresis combined with methylprednisolone to treat diffuse proliferative lupus nephritis[J].
J Clin Apher,2015, 5 (28) : 21408.
(0)
|